CPT2 F352C突变小鼠EV71感染模型的构建及其脑干损害的机制研究.pdf

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1、分类号：R725密级：公开学校代码：11065学号：2015010035博士学位论文CPT2F352C突变小鼠EV71感染模型的构建及其脑干损害的机制研究作者姓名李菲指导教师陈宗波教授学科儿科学培养单位医学部儿科学系答辩日期2018年5月13日CPT2F352C突变小鼠EV71感染模型的构建及其脑干损害的机制研究摘要第一部分构建CPT2F352C突变小鼠模型研究目的：肉毒碱棕榈酰基转移酶2（CarnitinePalmitoyltransferase2，CPT2）F352C突变与肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）脑炎的发生发

2、展显著相关，本项目将通过构建与人类一致的CPT2F352C点突变小鼠，为在体内水平研究CPT2F352C突变加重EV71脑炎脑干损伤的机制提供更好的动物模型。研究方法：通过与NCBI数据库，比对人源和小鼠源CPT2序列，明确CPT2蛋白在人源和小鼠源第352号氨基酸都是苯丙氨酸，采用CRISPR/Cas9技术建立点突变小鼠。利用ZhangLab的在线设计软件http://crispr.mit.edu设计guide-RNA，并根据突变位点设计单链供体序列OligoDonorDNA，利用NotI位点将Cas9质粒线性化，使用mMESSAGEmMA

3、CHINE®T7UltraKit进行体外转录；guide-RNA模板使用MEGAshortscript™Kit进行体外转录。转录产物都使用MEGAclearTMKit纯化，取4-6周龄C57BL/6J雌鼠超排后与性成熟的C57BL/6J雄鼠交配，挑选见栓鼠取受精卵，培养在M2培养基中，将纯化的Cas9mRNA和guide-RNA注射到受精卵中，注射后的受精卵移植到假孕鼠的输卵管，每只假孕鼠输卵管单侧移卵约25枚。胚胎移植成功后，F0代小鼠娩出。提取F0代小鼠小鼠基因组DNA，利用PCR技术扩增后，测序鉴定小鼠基因型，将阳性F0代小鼠继续与野生

4、型小鼠杂交繁育以便获得能稳定遗传的CPT2F352C点突变小鼠。连续观察小鼠的生长发育情况，记录每周的体重变化，提取突变小鼠及野生型小鼠脑干组织脑干组织总RNA，利用RT-PCR技术检测CPT2mRNA表达，提取突变小鼠及野生型小鼠脑干组织脑干组织总蛋白，利用WesternBlot检测CPT2蛋白的表达。同时测定突变小鼠及野生小鼠脑干组织CPT2剩余酶活性及ATP水平。结果：经基因型鉴定，共获得4只目的基因点突变的阳性F0代小鼠，经繁育后获得实验所需的纯合型CPT2F352C突变和野生型小鼠。连续观察CPT2F352C突变小鼠和野生型小鼠的生

5、长发育情况8周，结果发现，CPT2F352C突变小鼠和野生型小鼠相同性别的体重增长状况无明显差别，两者的的mRNA水平及蛋白表达也无差异。在无任何干预的情况下，正常CPT2F352C突变小鼠和野生型小鼠的脑干组织中CPT2剩余酶活性及ATP水平也无显著统计学意义。结论：成功建立了CPT2F352C点突变小鼠模型，为研究CPT2F352C突变后加重EV71脑炎脑干损伤的机制提供了重要的动物模型。I博士研究生：李菲（儿科学）指导教师：陈宗波教授关键词：肉毒碱棕榈酰基转移酶2，突变，动物模型IICPT2F352C突变小鼠EV71感染模型的构建及其脑

6、干损害的机制研究摘要第二部分CPT2F352C突变加重EV71脑炎脑干损伤的机制研究目的：在前期构建的CPT2F352C突变小鼠基础上，研究EV71感染后不同发热状态小鼠的临床症状、脑干组织病毒载量、CPT2的功能、细胞因子的变化及脑干线粒体超微结构和血脑屏障结构的改变，探讨CPT2F352C突变加重EV71脑炎脑干损伤的机制。研究方法：利用人横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma，RD）细胞扩增浓缩EV71BrCr毒株，经腹腔注射给予野生型小鼠及CPT2F352C突变小鼠不同量的病毒液，筛选出能产生EV71感染神经症状的最佳病毒量。将

7、7日龄20窝野生型小鼠及20窝CPT2F352C突变小鼠随机均分为2组，分别为EV71感染组17窝和非感染组3窝，感染组小鼠根据其体温变化，分为高热组(>35.5℃)和非高热组。连续观察各组小鼠EV71感染症状，各组分别于病毒接种前、病毒接种后第3天、第7天、第10天、第14天用苯巴比妥安乐死8只，取出脑干组织，提取总RNA和总蛋白。RT-PCR检测脑干组织中的EV71病毒载量及CPT2mRNA表达量，WesternBlot检测CPT2蛋白的表达，测定各组小鼠CPT2剩余酶活性及ATP水平，酶联免疫吸附法（Enzyme-LinkedImmun

8、oSorbentAssay）检测脑干组织中细胞因子白细胞介素-1β（Interleukin-1beta，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TumorNecrosisF