sirt1对硬皮病模型小鼠的干预作用及其机制研究

《sirt1对硬皮病模型小鼠的干预作用及其机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、复旦大学博士学位论文Sirt1对硬皮病模型小鼠的干预作用及其机制研究姓名：朱小霞申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：邹和建2012-04中文摘要Sirtl对硬皮病模型小鼠的干预作用及其机制研究研究背景与目的硬皮病是一种慢性自身免疫性疾病，以多脏器炎症和弥漫性纤维化为特征。其病因及发病机制不明，目前认为硬皮病患者的皮肤纤维化是由于成纤维细胞过度活化导致胶原、纤维连接蛋白和糖胺聚糖等细胞外基质的沉积增加所造成。硬皮病早期，炎症反应是其主要表现，也是进一步促进成纤维细胞活化并合成细胞外基质的主要因素。其中，

2、细胞因子网络失衡，如肿瘤坏死因子．alpha(tumornecrosisfactor．aLlpha，1NF．a)和白介素．1beta(interleukin-1beta，IL．113)等多种促炎症因子参与了成纤维细胞的活化。因此，抑制炎症信号通路可能有望阻断硬皮病的病情进展。近期研究发现沉默调节蛋白1(silentinformationregI．tlator1，Sirtl)可能通过抑制NF．r,B的转录活性，下调多种炎症相关因子的表达，从而缓解炎症。此外，Sirtl具有调节免疫和调节细胞分化、增生的功能。

3、白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种多酚类天然植物抗毒素，为Sirtl的激动剂之一。研究认为白藜芦醇有明显抑制炎症、调节免疫的作用，鉴于近期有研究报道白藜芦醇可能不直接通过激活Sirtl而发挥作用，因此其机制是否依赖于Sirtl仍有待进一步探讨。本文通过对博来霉素诱导的C3H／He小鼠硬皮病模型和3T3／NIH小鼠胚胎成纤维细胞的研究，阐明Sial及其激动剂白藜芦醇在硬皮病中的抗炎症、抗纤维化作用，并探讨二者的作用机制。研究内容与方法体内研究：C3H／He小鼠背部皮下注射博来霉素(0．2mg／

4、ml，100I_t1)，每日一次，连续三周，诱导硬皮病小鼠模型。取小鼠背部注射点局部病变皮肤组织，用HE染色和Masson特殊染色鉴定硬皮病小鼠发病情况，免疫组织化学法和酶联免疫吸附法(ELISA)检测Sirtl表达的变化。于不同时间点给予不同剂量的白藜芦醇干预治疗(腹腔注射)硬皮病，每复旦大学博士论文日一次，四周后处死小鼠，通过HE染色和Masson特殊染色观察病变皮肤组织病理变化，RT-PCR检测小鼠皮肤组织中基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase9，MMP9)、IL-6，诱

5、生型一氧化氮合酶(inducednitricoxidesynthase，iNOS)的表达改变。体外研究：应用重组鼠源TNF．Q刺激3T3／NIH小鼠胚胎成纤维细胞，诱导体外细胞炎症模型；于TNF．a刺激前后的不同时间点给予不同剂量白藜芦醇处理细胞，并通过明胶酶谱法、Western印迹法和real-timePCR检测MMP-9、IL-19、IL-6和iNOS的表达变化以及NF．r．B亚单位RelA／p65乙酰化水平的改变。为进一步探索Sirtl炎症抑制作用的具体机制，我们应用siRNA干扰技术阻断Sirtl

6、在成纤维细胞中的表达，同样条件下再给予白藜芦醇和TNF-a处理细胞，检测上述炎症相关因子表达水平和RelA／p65乙酰化水平的变化：此外，通过Western印迹法检测mTOR通路在TNF．0【诱导的炎症中的变化，以及Sirtl对该通路的调节作用。研究结果体内研究：博来霉素诱导的硬皮病小鼠背部病变皮肤的组织学检查可见明显炎症细胞浸润，皮肤真皮层变性、增生、纤维化，皮肤厚度增加，胶原沉积；real．timePCR结果显示病变皮肤组织中MMP9、IL．6和iNOS的mRNA表达明显增加：ELISA和免疫组织化学

7、检测发现硬皮病小鼠病变皮肤组织中Sirtl表达水平升高。给予Sirtl激动剂白藜芦醇治疗后，上述病理病变明显缓解，胶原沉积减少，炎症浸润缓解，上调的MMP9、IL．6和iNOSmRNA表达也被抑制；白藜芦醇这种抑制炎症的作用呈剂量和时间依赖性，尤其在博来霉素刺激之前开始给予白藜芦醇预防治疗，可明显抑制博来霉素诱导的炎症、纤维化反应。体外研究：重组鼠源TNF．伍可诱导成纤维细胞炎症反应，包括MMP9、IL-1p、iNOS、4中文摘要IL．6的表达上调，呈时间和剂量依赖性。给予白藜芦醇干预处理细胞后发现：白藜

8、芦醇可显著抑制TNF．a诱导的MMP9分泌，呈剂量依赖性；同时，白藜芦醇也下调TNF．a诱导的IL．1p、iNOS、IL．6mR_NA表达，尤其是在TNF—a刺激前1小时预处理，效果明显优于炎症后处理。TNF一0【可诱导3T3／NIH成纤维细胞NF—rd3亚单位RelA／p65的乙酰化，呈时间依赖性，在TNF．a刺激后30分钟RelA／p65赖氨酸310位点的乙酰化水平开始升高，并于刺激后3～9小时达高峰。白藜芦醇抑制炎症的同