fmnl2诱导结直肠癌侵袭性伪足形成的分子机制

《fmnl2诱导结直肠癌侵袭性伪足形成的分子机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、南方医科大学2013级博士学位论文FMNL2诱导结直肠癌侵袭性伪足形成的分子机制MolecularMechanismoftheformationofInVadopodiaincolorectcalcancerinducedbyFMNL2课题来源：自选学位申请人乔玉丹导师姓名丁彦青，梁莉专业名称病理学与病理生理学培养类型学术型培养层次博士研究生所在学院基础医学院2013年5月17日广州l哪籼哪删咖叭㈣删l肌Y2405712博士学位论文FMNL2诱导结直肠癌侵袭性伪足形成的分子机制博士研究生：乔玉丹指导教师

2、：丁彦青教授梁莉教授研究背景和研究目的摘要结直肠癌是常见的恶性肿瘤，已经成为我国三大癌症之一，在西方发达国家，结直肠癌是仅次于肺癌的第二位恶性肿瘤。30～,40％的结直肠癌患者行根治性手术治疗和放化疗等综合性治疗后发生肝肺转移，一旦出现转移很快威胁到患者的生命。因此，阐明结直肠癌转移的分子机制，控制转移是当前研究的重要方向。目前认为，转移的肿瘤细胞所经历的粘附特性的丧失、运动能力的增强、表达蛋白水解酶及新生血管形成等一系列改变，是侵袭和转移必不可少的过程。当遇到各种细胞内外信号刺激时，肿瘤细胞随时、精确

3、地改变形状和运动行为需要肌动蛋白和微管蛋白的不断重建，使细胞内的微丝、叶状伪足、层状伪足、侵袭性伪足等不断发生动态改变，从而适应侵袭和转移等过程。伪足形成和细胞形态改变是侵袭转移的起始步骤，细胞迁移头部高度动态性伪足结构的形成依赖肌动蛋白单体聚合和肌动蛋白纤维的延长。丝状伪足和层状伪足在肿瘤侵袭起始阶段起粘附作用，侵袭性伪足与细胞外基质降解密切相关n1。前期工作中，我们筛选出在高转移结直肠癌细胞中表达上调的FMNL2基因，是重要的肌动蛋白成核因子，并首次探讨了FMNL2在结直肠癌侵袭和转移中的作用机摘要

4、制，结果显示FMNL2在结直肠癌细胞株和组织中高表达，且与淋巴结转移相关【2J；它能通过诱导上皮．间质转化，促进结直肠癌细胞侵袭和转移【3】；此外，HMGAl／miR．137／FMNL2轴参与结直肠癌侵袭和转移[41。文献报道，FMNL2作为Cdc42的效应蛋白促进层状伪足尖端的肌动蛋白聚合和微丝的延长促进细胞的运动【5j；FMNL2作为RhoC的效应蛋白促进癌细胞的圆形和阿米巴虫样或间充质样侵袭迁移【6J。由此可见，FMNL2能够调节肌动蛋白相关的癌细胞侵袭和运动，然而其具体机制是什么?是否有相互作用

5、蛋白参与其中?该作用受到哪些信号通路的调节?以上问题尚不清楚，目前有关FMNL2相互作用蛋白的研究尚未见报道。本研究将对FMNL2相互作用蛋白进行筛选，从中选择作用于结直肠癌细胞运动和侵袭的候选蛋白，从侵袭性伪足的角度进一步阐述其参与结直肠癌侵袭和转移的分子机制。旨在揭示FMNL2参与结直肠癌转移的新机制，为临床干预肿瘤转移提供新的潜在应用靶点。研究方法1．FMNL2相互作用蛋白的筛选和鉴定1)利用酵母双杂交试验初步筛选FMNL2的相互作用蛋白，结合文献选择可能作用于癌细胞运动和侵袭的一个基因作为研究靶

6、点；2)分别以FMNL2、SHANK2、cortactin抗体进行免疫共沉淀；3)荧光共聚焦分别观察FMNL2和SHANK2，FMNL2和cortactin，FMNL2、SHANK2和cortactin的共定位；4)利用WesternBlot和Q．PCR检测30对人结直肠癌细胞株中相互作用蛋白FMNL2、SHANK2、cortactin的表达；免疫组化检测人结直肠癌组织中FMNL2、SHANK2、cortactin的表达；并进行相关性分析；2．FMNL2在侵袭性伪足形成中的作用1)在4株人结直肠癌细胞中

7、，利用免疫双荧光标记cortactin和F．actin观博士学位论文察侵袭性伪足的形态和数目；2)利用免疫双荧光标记FMNL2与F．actin，观察FMNL2与侵袭性伪足的共定位；3)以pEGFP．C1为骨架构建actin表达载体；瞬时转染SW620细胞，利用活细胞成像技术观察侵袭性伪足的动态改变；4)利用阳离子脂质体法将FMNL2．SiRNA(以NC．SiRNA为对照)瞬时转染Lovo和SW620细胞，pCDNA3．0．FLAG．FMNL2．CT(以pCDNA3．0．FLAG为对照)瞬时转染HT29和

8、SW480细胞48h后，行WeaemBlot和Q．PCR鉴定；5)在Lovo／SiFMNL2、SW620／SiFMNL2、SW480／FMNL2和HT29／FMNL2细胞中，进行TRITC．鬼笔环肽和cortactin免疫荧光共定位观察，比较转染前后侵袭性伪足的形态和数量；6)将Lovo／SiFMNL2、SW620／SiFMNL2、SW480／FMNL2和HT29／FMNL2细胞铺入猪源性绿色荧光明胶制备的共聚焦小皿中进行原位明胶降解实验，