结核杆菌分泌蛋白esat6、cfp10对细胞凋亡及免疫影响的初步研究

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1、分类号：密级：学号：2010108023单位代码：10759石河子大学硕士学位论文结核杆菌分泌蛋白ESAT6、CFP10对细胞凋亡及免疫影响的初步研究学位申请人李跃峰陈创夫教授指导教师曹旭东副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称基础兽医学研究方向动物疾病病理学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年6月StudyontheapoptosisandimmuneefficacyofmycobacteriumtuberculosisESAT6/CFP10ADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillment

2、oftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByLiYuefeng(BasicVeterinaryScience)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuProf.CaoXudongJune,2013II课题来源国家自然科学基金课题名称：毒力因子CFP10在结核杆菌感染巨噬细胞过程中与宿主因子相互作用的机理研究项目编号：31060333石河子大学高层次人才科研启动资金专项课题名称：结核杆菌毒力因子ESAT6、CFP10对巨噬细胞Ca2+通道影响的初步研究项目编号：Rczx201027摘要

3、目的：结核杆菌属胞内寄生菌，比较基因组学对卡介苗和H37RV进行对比，发现所有卡介苗缺失RD1区。研究发现RD1区存在于所有的致病性结核分枝杆菌，而结核杆菌毒力的强弱与细胞的凋亡成负相关。有假说认为RD1区的分泌蛋白ESAT6和CFP10与细胞的凋亡有关。卡介苗是目前唯一应用的结核病疫苗，但是卡介苗对成人的保护效果低。本试验对分泌蛋白ESAT6、CFP10与细胞的凋亡关系进行研究，并用构建的ESAT6和CFP10真核表达载体分别与卡介苗一起免疫小鼠，检测抗体和IFN-γ的变化，为开发新的疫苗提供数据参考。方法：(1)设计ESAT6、CFP10基因的引物，以灭活的结核杆菌H37Rv为

4、模板，用PCR方法扩增得到ESAT6、CFP10基因全长。(2)将ESAT6、CFP10基因与T载体连接，构建克隆载体pGM18-T-ESAT6、pGM18-T-CFP10；双酶切克隆载体pGM18-T-ESAT6、pGM18-T-CFP10后，将ESAT6、CFP10基因分别与pEGFP-N1真核表达载体连接，构建重组真核表达载体pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10。(3)用pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10重组真核表达载体转染293T细胞，荧光显微镜观察细胞转染结果。用WesternBlot方法对细胞蛋白样进行分析。(4)用激光共聚

5、焦显微镜对转染的293T和U937细胞进行定位分析。(5)对转染的293T细胞用流式细胞仪进行凋亡率分析，用荧光实时定量PCR仪进一步对细胞中凋亡相关基因的变化进行分析。(6)将pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10重组真核表达载体分别与卡介苗一起联合免疫小鼠，检测其血清中的抗体及IFN-γ的变化。结果：(1)质粒PCR、双酶切和测序验证表明pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10重组真核表达载体构建成功。(2)pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10重组真核表达载体转染细胞后表达出绿色荧光，WesternBlot结果表明ES

6、AT6、CFP10在细胞内正确表达。(3)激光共聚焦显微镜观察结果显示，转染pEGFP-N1-ESAT6后，绿色荧光主要分布于293T细胞和U937细胞的细胞质；转染pEGFP-N1-CFP10后，绿色荧光在293T细胞分布于细胞质，而在U937细胞中绿色荧光除在细胞质分布外，也分布于细胞核的部分区域。(4)流式细胞仪分析结果表明转染pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10组细胞凋亡率均上升，用荧光实时定量PCR进一步分析表明，两组细胞中Caspase8基因的相对表达量在12h、24h、48h时有显著上调，Bcl-2基因在48h时相对表达量有显著下调，Caspas

7、e3基因的相对表达量在48h时相对表达量有显著上调，Bax、AIF基因在12h、24h、48h时相对表达量变化不显著。(5)pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10分别与卡介苗一起免疫小鼠两次后，结果表明在小鼠血清中未检测到针对ESAT6、CFP10蛋白的抗体，但小鼠血清中IFN-γ水平有显著上升。I结论：(1)获得了结核杆菌ESAT6和CFP10基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10。(2)pEGFP-N1