具抗病毒活性无冗余氨基酸牛α干扰素(a亚型)表达策略的研究

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1、摘要摘要干扰素(Interferon，IFN)是由机体特定细胞产生的一类具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能等多种生物活性的分泌型糖蛋白，是机体防御系统的重要组成部分。在众多干扰素类型中，干扰素0【的广谱抗病毒能力最为显著。体外表达的重组牛Of,干扰素(BovineInterferon·0c，BolFN．c【)蛋白可以抑制水泡性口炎病毒(vsv)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛病毒性腹泻病毒fBVDV)和副流感病毒(Ply)等病毒的增殖和复制。至今为止，大肠杆菌表达系统和巴斯德毕赤酵母表达系统是表达重组牛0l干扰素的

2、普遍系统。然而，重组牛c【干扰素在大肠杆菌表达系统中多以无生物学活性的包涵体形式存在，在毕赤酵母表达系统中多存在蛋白表达不稳定、产量低等问题。因此，探索出一套可以稳定直接表达具有生物学活性无冗余氨基酸的重组牛a干扰素的方法就更具生产与应用价值。本研究综合多种有利于直接表达具有活性重组蛋白的条件创建了三种具抗病毒活性牛0【干扰素表达策略，即大肠杆菌周质分泌表达策略、大肠杆菌内含肽融合标签表达策略和巴斯德毕赤酵母分泌表达策略。前两种表达策略利用大肠杆菌表达系统，以原有pWL—BolFN—cc质粒为模板，PCR获得

3、经过遗传密码子优化后的牛a干扰素A亚型基因，分别与信号肽基因和内含肽基因无缝融合，构建了pET-22b—pelB．BolFN．a、pMal．c2X．SDI—BolFN．Q、pColdlII．SDI．BolFN．q等一系列表达载体，最终实现具抗病毒活性的牛a干扰素A亚型蛋白在大肠杆菌表达系统中的活性表达。巴斯德毕赤酵母分泌表达策略，以新鲜牛肝脏提取的牛基因组为模板，PCR获得成熟肽天然牛Ⅱ干扰素A亚型基因，将此基因连接入载体pPICZo．A中，成功构建毕赤酵母分泌型表达载体pPICZo．A．BolFN-ci，实

4、现牛O【干扰素A亚型重组蛋白在真核毕赤酵母表达系统中的高效具活性分泌表达。三种具抗病毒活性表达策略共获得了四种活性牛a干扰素蛋白，通过细胞病变抑制法，在MDBK细胞上检测其对VSV和BVDV的抗病毒活性，并且对四种活性蛋白的存在形式、表达量、抗VSV活性、抗BVDV活性和培养成本等进行对比，得出巴斯德毕赤酵母表达系统表达牛0c干扰素更适于工业化的开发和大规模生产，为研制和工业化生产牛抗病毒干扰素制剂做出了有意义的探索。关键词：牛c【干扰素；具活性表达：原核表达；巴斯德毕赤酵母；抗病毒活性AbstractExp

5、ressionstrategiesresearchofAntiviralActivitiesandaminoacidwithnoredundancyBovineInterferonalphaAInterferon(interferon，IFN)isaglucoproteinwhichsecretedbythecellswithabroad—spectrumanti—viral，anti—celldivision，immunomodulatoryactivityandindifferentwaysaffectc

6、ellmetabolism，growth．Interferonalphaisfamousasthepotentantantiviralfactors．Inourcountry．Inanumberofinterferontype．broad—spectrumantiviralactivityofinterferonccisthemostsignificant．Invitroexpressionofrecombinantbovinealphainterferon(Bovineinterferon—alphaBol

7、FN．0【)proteincaninhibitthevesicularstomatitisvirus(vsv)，footandmouthdiseasevirus(FMDV)，bovineviraldiarrheavirus(BVDV)andparainfluenzavirus(PIV)，theproliferationandreplicationofthevirus．Sofar，EcoliandPichiapastorisisthemostuniversalusedhostfortheproductionof

8、recombinantproteins．However，mostoftherecombinationproteinofEcoliaretapicallyobtainedasinsolubleinclusionbodiesthatneedsolubilizationandrefolding．AndtheproblemoftherecombinationproteinofPichiapastorisis