猪α、β、γ干扰素的表达及抗病毒活性的检测

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1、山东农业大学硕士学位论文猪α、β、γ干扰素的表达及抗病毒活性的检测姓名：崔然申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：周恩民20120615山东农业人学硕士学位论文中文摘要．干扰素(Interferon，IFN)是在特定的诱导剂作用下，一类由细胞分泌的，在同种细胞上，具有广谱抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能等活性的细胞因子。其活性受基因的调控，涉及RNA和蛋白质的合成环节。自发现以来，IFN的研究是细胞因子研究中最活跃、进展最快的领域之一，也是病毒学、细胞学、分子生物学、免疫学和肿瘤学等相关领域的研究热点。我国是养猪大国，猪的各类疾病，尤其是病

2、毒性疾病一直严重危害着养猪业的发展，降低了经济效益，迫切需要研制高效低成本的抗病毒和增强免疫效果的药物。基于猪IFN具有广谱抗病毒、抗肿瘤及免疫调节作用，如何有效的将猪IFN应用于猪病的防治，已成为研究热点。猪IFN分为I型和II型，目前已知并且被广泛研究的有Gt、p和丫三种。IFN．a、p属于I型，具有抑制病毒复制和抗肿瘤的作用；IFN吖属于II型，除具有抗病毒作用外，参与细胞主要组织相容性复合物(Majorhistocompatibilitycomplex，MHC)抗原的表达和免疫调节反应，在免疫调节中有重要作用。本实验目的是探索原核、真

3、核表达的重组猪IFN在不同细胞系上抑制不同病毒增殖的作用。利用pGEX．6p．1原核表达载体，构建了猪IFN．a、p、丫基因的原核表达载体，诱导表达出部分可溶的重组猪IFN蛋白后，进行纯化。将蛋白免疫BALB／c小鼠，分别制备了效价在l"10，000以上的猪IFN．a、p、丫多克隆抗体。同时将猪IFN一0【、p、丫基因连接到转移载体pFastBacruHTB上，构建了猪IFN．a、p、7重组Bacmid杆状病毒载体，利用Bac．To．Bac杆状病毒表达系统，在sf9昆虫细胞中成功表达出重组猪IFN．a、p、丫蛋白。用细胞病变抑制法，在PRRS

4、V(猪繁殖与呼吸综合征病毒)／Mare．145和VSV(水泡性口炎病毒)／MDBK系统上对原核和真核表达的重组猪IFN．0【、13、丫蛋白进行抗病毒活性检测。结果表明，原核和真核表达的重组猪IFN．a、p、丫蛋白都具有显著的抗PRRSV和VSV的活性。其中，重组猪IFN．。【抗病毒活性较高，约为猪IFN．p活性的2倍，猪IFN-3'活性的2．6倍。并且sf9昆虫细胞真核表达的重组猪IFN蛋白活性是原核表达的重组猪IFN蛋白活性的l-4倍。在抗病毒活性实验中，重组猪IFN．a、13、7蛋白对PRRSV的抗病毒活性达到10510白U／mgj说明表

5、达的重组猪IFN有成为治疗猪繁殖与呼吸综合征，乃至其他猪病的蛋白类药物的潜力。关键词：猪0【、13、丫干扰素；原核表达；多抗制备；杆状病毒表达系统；抗病毒活性ExpressionandAntiviralActivityDetectionofPorcineIFN—Gt，D，丫AbstractInterferon(IFN)isakindofcytokinewhichisinducedbyparticularinducers，secretedbycells．Inthesamekindofcells，ithastheactivitiesofbroad

6、—spectrumantivirus，antitumorandregulationoftheimmunefunction．SinceIFNbeingdiscovered，theresearchofIFNhasbeenoneofthemostactiveandfastestdevelopmentalfieldsofcytokineresearches．Anditisalsothefocusofresearchesaboutvirology,cytology,molecularbiology,immunology,oncologyandsomer

7、elatedfields．Ourcountryhasbighogareas．Allkindsofporcinediseases，especiallytheviraldiseases，havebeenveryharmfultothedevelopmentofpigindustryandreducedtheeconomicbenefits．ThemedicinewhichisefficientbutlowcostonantivirusandCanenhancetheeffectofimmunitywillbeurgentlyneeded．Base

8、donthefunctionofbroad-spectrumantivirus，antitumorandimmuneregulationofporcineIFN，h