新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改进

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1、第31卷／第2期／河北师范大学学报／8然科学版／Vo1．31No。22007年3月JOURNALOFHEBEINORMALUNIVERSITY／NaturalScienceEdition／Mar．2007新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改进王娜，一，关鹏，段相林，李清，常彦忠，石振华(1．河北师范大学生命科学学院，河北石家庄050016；2．河北医科大学基础课部，河北石家庄050091)摘要：探讨更为简单的SD大鼠心肌细胞原代培养的方法，使分离的心肌细胞达到理想的存活率和纯度，为临床应用建立心肌细胞模型．取出生24h

2、内SD大鼠的左心室。剪碎、消化、分离和纯化。进行培养。0．1g／L胰酶消化，可以分离到形态完整、贴壁生长的心肌细胞．进一步通过离心、差速贴壁和化学试剂抑制非心肌细胞生长，纯化得到95％以上的心肌细胞．成功建立了心肌细胞体外培养模型，获得了高纯度的心肌细胞．关键词：新生大鼠；心肌细胞；原代培养中圈分类号：Q813．11文献标识码：A文章编号：1000—5854(2007)02—0256—04原代培养的心肌细胞具有自发搏动性、可控性好、重复性好等结构与功能特点[，是研究单一因素对心肌细胞影响的理想模型，可在不受神经体液

3、因素的影响下，对药物和其他因素的影响进行直接观察[2-3】。纯化的心肌细胞均一性好，特别适用于生物化学方面的研究；可对作用于心脏的新药进行筛选，并对其安全性进行评价；能从培养的心肌细胞中提取有价值的生物因子；能利用心肌细胞进行建立胚胎干细胞条件培养基的研究HJ．总之，心肌细胞的原代培养技术越来越被人们所重视。虽然已有心肌细胞培养方法的报道，但存在细胞存活率低、纯度不高等缺陷．笔者实验室经过长期尝试，摸索出了简单并且稳定、可靠的培养心肌细胞的方法．1材料与方法1．1实验动物和试剂新生24h内的SD大鼠10～15只，D

4、MEM培养基(Invitrogen公司)，胎牛血清(四季青公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，Brdu(Sigma公司)，a．SA(Sigma公司)，ABC免疫组化试剂盒(Sigma公司)，DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)．培养基I：DMEM培养基，100g／LFBS，1g／L青一链霉素。培养基1I：DMEM培养基，0。1mmol／LBrdu，1g／L青-铝圭霉素。培养基Ⅲ：DMEM培养基．1．2方法】．2．1细胞的制备和培养在超净工作台中将新生大鼠颈椎脱臼处死，开胸取出左心室，用PBS反复冲洗，以洗净残留积血．

5、将心室剪成1mm0心肌组织块J，用1g／L的胰蛋白酶在37℃水浴消化10min，弃上清液，再加入胰蛋白酶液消化10min，将上清液转移到另一支无菌离心管中，并加入等体积的培养基I终止消化。给沉淀的心肌组织块再加入胰蛋白酶溶液反复消化，至心肌组织块完全消化为止．将心肌细胞悬液离心弃上清．沉淀物中加入1～2mL的培养基I，用吸管轻轻吹打制成心肌细胞悬液，分装于六孔板中，置于培养箱中培养2h[．非心肌细胞贴壁速度较快，首先贴壁，而心肌细胞仍处于悬浮状态，此时将心肌细胞悬液按实验要求的密度重新接种于六孔板中．第2天换培养基

6、Ⅱ培养2d[8-9]，以抑制非心肌细胞增殖．换培养基Ⅲ培养，此时的细胞为较纯的心肌细胞．收稿日期：2006—10—23；修回日期：2006—12—19基金项目：河北省自然科学基金(303158)；河北师范大学博士基金(B2002010)作者简介：王娜(1976一)。女，河北定州人，河北医科大学助教，河北师范大学硕士研究生，主要从事心血管疾病的研究通讯作者：石振华(1965一)，男，副教授，主要从事生物化学研究．E—mail：shizhhtom@126com·257·1．2．2心肌细胞质量评定1)心肌细胞形态学的观察

7、．将培养2，12，24，30，72h的细胞在倒置相差显微镜(Leica—IM40)下观察和照相．2)心肌细胞活性测定．采用台盼蓝染色，测定心肌细胞活性．3)心肌细胞活力测定．分别在培养的第3，6，9，12，15天于倒置显微镜下随机计数l0个心肌细胞的搏动频率．4)心肌细胞纯度检查．采用抗横纹肌肌动蛋白(a—sarcomericactin，a—SA)抗体的免疫荧光染色对心肌细胞进行鉴定．2结果2．1原代培养的心肌细胞形态学观察在倒置相差显微镜下观察，刚分离的心肌细胞呈球形(图la)；培养2h后成纤维细胞基本完全贴壁，

8、而心肌细胞刚刚开始贴壁生长，细胞在细胞培养板底逐渐展开，伸出伪足，由圆形变为三角形、多边形等形态(图lb)；12h后心肌细胞基本贴壁，少数贴壁的单个心肌细胞出现了自发性搏动，搏动的频率、节律各不同(图lc)；到24h后搏动的心肌细胞百分率大约为50％，搏动频率较分散，约50～150次／min(图ld)；至30h后，视野内搏动的心肌细胞百分率大于90％，搏动频