脂多糖诱导肺成纤维细胞表型转变及异常增殖的机制研究

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1、博士专业学位论文论文题目脂多糖诱导肺成纤维细胞表型转变及异常增殖的机制研究研究生姓名皋源指导教师姓名杨建平专业名称外科学研究方向危重病治疗论文提交日期2013年3月脂多糖诱导肺成纤维细胞表型转变及异常增殖的机制研究中文摘要脂多糖诱导肺成纤维细胞表型转变及异常增殖的机制研究中文摘要肺纤维化是急性肺损伤（acutelunginjury,ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS）发展的重要病理阶段，以肺成纤维细胞异常增殖、活化并分泌胶原蛋白，形成肺间质和肺泡内弥散性纤维化为特点。革兰氏阴性杆菌细胞壁的脂多糖（lipopolysacch

2、aride,LPS）可以作用于肺成纤维细胞的特异性受体—Toll样受体4（Toll-likereceptor4,TLR4），并直接引起肺成纤维细胞的活化和增殖，与肺纤维化发生密切相关。然而LPS对成纤维细胞增殖作用的研究结果很不一致，提示不同来源的成纤维细胞亚型可能因存在着不同的表型而产生异质性（heterogeneity），其可能是细胞对LPS刺激产生不同生物学效应的重要原因。Thy-1是成纤维细胞表面由糖磷脂酰肌醇锚定的糖蛋白，根据细胞表面胸腺细胞分化抗原-1（thymocytedifferentiationantigen1,Thy-1）表达的情况，可以将肺成纤维细胞分为Thy-1(＋)

3、及Thy-1(－)两种不同的表型。Thy-1在正常肺成纤维细胞表面大量表达，但是在特发性肺纤维化（idiopathicpulmonaryfibrosis,IPF）患者肺组织存在着大量Thy-1呈阴性表达的Thy-1(－)肺成纤维细胞。Thy-1(－)的肺成纤维细胞在各种致纤维化因子刺激下具有更活跃的反应能力，与肺纤维化的发生和发展密切相关。有研究表明Thy-1基因表达受组蛋白去乙酰化等表观遗传学机制的调控，也有研究表明LPS可以通过组蛋白去乙酰化等表观遗传学机制调控多种基因的表达。但是，目前尚未明确LPS是否通过表观遗传调控作用抑制肺成纤维细胞Thy-1基因的表达而改变细胞的表型，引起肺成纤

4、维细胞的增殖。本课题拟利用LPS诱导肺成纤维细胞增殖的模型，首先明确LPS直接诱导原代培养的Thy-1(＋)肺成纤维细胞发生表型转变的和异常增殖的作用；随后通过RNAi技术抑制肺成纤维细胞TLR4的表达，研究LPS通过TLR4对肺成纤维细胞Thy-1基因表达以及细胞表型转变和异常增殖的表观遗传学调控作用。资助基金项目：国家自然科学基金（编号：81000025，81270122）I中文摘要脂多糖诱导肺成纤维细胞表型转变及异常增殖的机制研究第一部分脂多糖诱导肺成纤维细胞表型转变的作用研究目的：明确在急性肺损伤肺纤维化早期，脂多糖（LPS）诱导肺成纤维细胞增殖及表型转变的作用。方法：原代培养小鼠肺

5、成纤维细胞，以终浓度为0.01μg/ml、0.1μg/ml和1μg/ml的LPS刺激细胞，并设阴性对照；LPS作用0h、6h、24h、48h和72h后以CCK-8（cellcountingkit-8）细胞计数试剂盒检测细胞增殖情况，以real-timePCR检测各组细胞Thy-1mRNA的动态表达情况。结果：原代培养的小鼠肺成纤维细胞Thy-1基因呈阳性表达；以不同浓度LPS刺激细胞最初24小时内未见细胞明显增殖，48-72小时后细胞增殖速率显著增加，同时伴有Thy-1基因表达量显著下降，经统计学检验差异存在显著性（P<0.05）。相对于0.01μg/ml和0.1μg/ml两个浓度，以1μg

6、/ml的LPS刺激细胞产生的细胞增殖及Thy-1基因表达下调的反应更为显著。结论：LPS可通过抑制肺成纤维细胞Thy-1基因的表达而使细胞发生表型转变并引起异常增殖。第二部分小鼠肺成纤维细胞TLR4siRNA序列的设计和siRNA慢病毒载体的构建目的：设计、构建和鉴定TLR4-RNAi慢病毒载体（Lentivirus-TLR4-siRNA）用于后续实验。方法：设计、制备3个针对TLR4基因的siRNA质粒并进行慢病毒包装。转染原代培养的小鼠肺成纤维细胞后通过Real-timePCR筛选RNA干扰最佳靶点。结果：经PCR鉴定和测序验证，成功构建了3个针对的TLR4基因的siRNA质粒并进行慢病

7、毒包装，形成TLR4-RNAi慢病毒载体（Lentivirus-TLR4-siRNA）；经Real-timePCR筛选出最佳TLR4-RNAi慢病毒载体（Target2＃），其病毒滴度测定结果为8×107TU/ml，抑制效率约80%。结论：针对TLR4基因的Lentivirus-TLR4-siRNA能有效抑制原代培养的小鼠肺成纤维细胞TLR4基因的表达，用于后续实验。II脂多糖诱导肺成纤维细胞表型转变及异常增