miR146a在脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤中的作用及机制研究

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者张手写％f如签字魄砂降学位论文版权使用授权书砌1日}本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行

2、检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所和中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)糊黼引矧：‰习锄引矧：岔渤久签字日期：驴／2年／月夕日签字日期：砂／序白7日研究背景和目的急性肺损伤(AcuteLungInjury，ALl)／急性呼吸窘迫综合征(AcuteRespiratoryDistressSyndrome，ARDS)指由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的肺部炎性反应，使肺

3、泡．毛细血管上皮细胞及肺部屏障结构受损，肺气体交换功能发生障碍，是一种以急性、进行性、顽固性低氧血症为特征的临床综合征，是目前导致危重病人死亡的主要原因。尽管不断出现新的治疗ALI／ARDS的方法，包括肺保护性通气策略、体外膜肺氧合、高容量血液滤过等，但其死亡率依然高达30％～50％。在ALI／ARDS发生发展过程中，肺泡巨噬细胞介导的固有免疫反应发挥着关键作用。当肺组织受到肺内外各种因素刺激时，可以活化肺泡巨噬细胞膜上的Toll受体(Toll．1ikereceptors，TLRs)，再经信号蛋白的转导活化核转录因子．KappaB(nuclearfactor．KappaB，NF．1c

4、B)，诱导大量炎症因子的表达释放，促使炎症反应的级联放大，形成肺内炎症“瀑布”反应，导致ALI／ARDS的发生。因此，抑制肺泡巨噬细胞过度活化、降低肺内炎症反应是治疗ALI／ARDS的根本措施。microRNA．146a(miR一146a)在固有免疫反应的调控中具有重要作用，它通过靶向沉默TLRs／NF．r．B信号通路中的两个关键信号转导蛋白，能够阻断NF．1(B活化，从而抑制炎症因子的释放，有望成为抑制肺泡巨噬细胞过度活化，降低肺内炎症反应的有效措施。本实验首先通过体外构建肺泡巨噬细胞炎症反应模型，观察miR-146a和炎症因子的表达变化，分析miR一146a在肺泡巨噬细胞炎症反应

5、中的调控作用，然后经体外转染miR一146amimic上调肺泡巨噬细胞内miR．146a的表达，观察miR．146a对炎症因子和炎症信号通路关键蛋白表达的影响，分析它在肺泡巨噬细胞炎症反应中的调控机制，最后于体内构建大鼠ALl模型，观察miR一146a在肺损伤组织中的表达变化，并结合体外研究结果，探讨其在大鼠ALl模型中的调控作用及作用机制，为临床治疗ALI提供新的治疗思路。研究内容和方法：1体外实验(1)将体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)按2×106个／孔接种于六孔一塑茎一—一—————————————————————-——————————————————_———————

6、———————————————一——板，细胞贴壁90min，加入终浓度llag／mlLPS处理细胞，于刺激Oh、3h、6h、12h的各个时间点收集细胞和细胞上清液。用实时荧光定量PCR(RT—qPCR)分别检测细胞中TNF．0【mRNA和miR．146a的表达变化，用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清液中TNF一值蛋白的表达变化；(2)将体外培养的NR8383细胞按1．5×106个／孔接种于六孔板，细胞贴壁90min，加入50nM浓度的miR．146amimic转染NR8383细胞24h后收集细胞。用RT．qPCR检测细胞中miR．146a上调的表达倍数和miR．146a

7、两个靶基因IRAK．1mRNA和TRAF．6mRNA的表达变化，用Westernblot检测细胞内IRAK．1和TRAF．6的表达变化，验证miR-146a转染的有效性以及验证miR．146a的靶基因；(3)将体外培养的NR8383细胞按1．5×106个／孔接种于六孔板，细胞贴壁90min，加入50nM浓度的miR-146amimic转染NR8383细胞24h，再加入终浓度199／mlLPS处理细胞6h后收集细胞和细胞上清液。用RT．qPCR检测细胞中TN