MicroRNA-204在角膜新生血管中的表达及其作用研究.pdf

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1、分类号：R5密级：公开学校代码：11065学号：2015010040学术博士学位论文MicroRNA-204在角膜新生血管中的表达及其作用研究作者姓名张晓萍指导教师史伟云主任医师学科眼科学培养单位医学部临床医学系答辩日期2018年5月20日MicroRNA-204在角膜新生血管中的表达及其作用研究摘要目的角膜无血管化状态维持着角膜的免疫赦免和透明性，眼外伤、感染、角膜移植等可引起角膜新生血管，影响视力甚至致盲，角膜新生血管也是引起角膜移植免疫排斥发生的重要原因。针对角膜新生血管发生过程中的炎症和血管内皮细胞变化，发展

2、了诸多抑制角膜新生血管的药物及方法，如糖皮质激素、FK506、抗VEGF等。常规缝线诱导角膜新生血管模型中存在角膜张应力的变化，张应力变化会诱导角膜中VEGF水平的升高，从而诱导角膜新生血管，但对于张应力如何调控角膜VEGF表达，进而影响角膜新生血管的机制还不明确。本研究拟检测已知的microRNAs在缝线和碱烧伤诱导的两种小鼠角膜新生血管模型中的表达变化，筛选出变化最为明显的microRNA；通过缝线诱导的小鼠角膜新生血管模型，检测该microRNA的表达定位，及其对新生血管形成的影响和机制；进一步通过体外培养人角

3、膜上皮细胞和微血管内皮细胞，观察张应力变化对该microRNA表达及其对微血管内皮细胞的影响。方法1.碱烧伤和缝线诱导的角膜新生血管中microRNAs的表达变化选择成年6~8周龄BALB/c小鼠为实验动物，碱烧伤模型采用浸润1N氢氧化钠的滤纸（直径2mm）置于角膜中央，作用40秒后，立即以生理盐水冲洗40秒，眼表涂氧氟沙星眼膏；缝线模型采用11-0线在角膜旁中央区板层放射状缝合2针；术后10天取角膜，RT-PCR检测角膜中miR-10a、16、24、101a、126b、184、200b、204的表达情况。2.角膜新

4、生血管中miR-204的表达变化和定位建立小鼠角膜缝线模型，术后通过裂隙灯观察新生血管生长情况，术后10天拆除缝线，观察至20天取角膜；RT-PCR分别检测角膜上皮和基质中miR-204的表达情况。取人正常角膜和人新生血管化的病变角膜，RT-PCR检测角膜上皮中miR-204的表达情况。取人正常角膜、人新生血管化的病变角膜、正常小鼠角膜和新生血管化小鼠角膜，用原位杂交法检测miR-204在角膜中的表达位置。I3.MiR-204对角膜新生血管的影响建立角膜缝线模型，将角膜缝线小鼠随机分为（1）PBS组：结膜下注射PBS

5、；（2）NTC组：结膜下注射NTC（agomirnegativecontrol）；（3）miR-204agomir组：分别在缝线0天、3天、6天结膜下注射。术后3天、5天、7天、10天裂隙灯显微镜观察，术后10天取角膜；CD31标记角膜新生血管，角膜铺片统计并比较角膜新生血管面积；免疫组织化学和Westernblot检测VEGF-A、VEGF-C、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3的表达变化。4.MiR-204对人角膜上皮细胞VEGF-A表达的影响体外培养人原代角膜上皮细胞，分为（1）正常对照组；（2）加力+N

6、TC组；（3）加力+miR-204agomir组；以Flexcell加力装置对细胞进行张应力作用（拉伸度5%，频率为1Hz，6小时），收取细胞，RT-PCR检测miR-204及VEGF-A的表达变化，Westernblot检测VEGF-A蛋白水平的变化。5.MiR-204对人微血管内皮细胞增殖、迁移及成管能力的影响体外培养人微血管内皮细胞，分为（1）正常对照组；（2）NTC组；（3）miR-204agomir组；培养基中加NTC或miR-204agomir处理后，CCK8法检测细胞增殖力、划痕法比较细胞迁移面积以及统

7、计成管能力。结果1.角膜新生血管中microRNAs的表达变化在缝线诱导的角膜新生血管模型中，术后第3天角膜缘即出现新生血管芽，到第10天时角膜水肿，血管生长旺盛，到达缝线位置甚至超越缝线；10天RT-PCR检测发现：miR-16、24、126b、184、200b、204低表达，miR-10a、101a表达无明显变化。在碱烧伤诱导的角膜新生血管模型中，术后2~3天角膜缘出现新生血管，10天取角膜RT-PCR检测，与正常角膜比较，新生血管化角膜中：miR-10a、16、24、184、204低表达，miR-126b、20

8、0b高表达，miR-101a表达无明显变化。2.MiR-204在新生血管化角膜中的表达变化角膜缝线10天时，角膜新生血管生长旺盛，RT-PCR检测到miR-204的表达水平明显低于正常角膜（p<0.05）；而且，与角膜松缝线比较，角膜紧缝线诱发更多的新生血管生长、miR-204降低更明显。10天拆除角膜缝线，观察至20天血管明显消退，取角膜，R