低氧诱导因子在大鼠角膜新生血管形成中的表达

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3、学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均适用上述授权。)声明人c签名，荐患叶年月日摘要背景角膜新生血管(cornealneovascularization，CNV)破坏角膜的透明性，影响视力，严重时甚至致盲。多种病理因素可以导致CNV的形成，但是CNV的形成机制目前还尚未明确。随着分子生物学的发展，人们对CNV的发病机制认识也日趋深入，低氧诱导因子在CNV发病机制中的作用也得到重视。研究发现低氧诱导因子(HIF)是各种低氧诱导基因调节的关键转录因子，可以上调多种靶基因的表达，但迄今为止，HIF参与新生血管形成的机制仍不清楚，角

4、膜中是否表达HIF及何种类型细胞表达HIF也不清楚。目的研究正常和缝线后大鼠角膜低氧诱导因子1C【和2旺(HIFlot、HIF2e)，随新生血管形成的表达变化和表达的细胞类型及与炎症细胞的关系，探讨HIF在角膜新生血管形成中可能的作用，为揭示角膜新生血管形成的机制提供依据。方法以缝线诱导方法建立大鼠角膜新生血管模型，将SD大鼠随机分为正常对照组和4个缝线实验组，每组15只。对照组不做任何处理，实验组进行角膜缝线诱导新生血管形成。在缝线后第l、3、5、7天，观察大鼠CNV的生长情况并记录CNV的生长面积，并取角膜组织分别进行提取RNA、蛋

5、白和固定及包埋切片，以实时荧光定量逆转录．聚合酶链式反应(Real．timeImPCR)、蛋白质免疫印迹(WesternBlot)、原位杂交(insituhybridization)和免疫组织化学(immunohistochemistry)等实验方法，检测HIFla和HIF2a在大鼠角膜缝线后各时间点的表达和细胞的定位。并通过RT-PCR方法克隆大鼠HIFla和HIF2a的cDNA，构建大鼠HIFla和HIF2a的表达载体，以检验能被HIFla和HIF2a抗体检测的大鼠角膜组织蛋白是否属于HIFla和HIF2a蛋白。结果对照组的角膜透明

6、无血管，实验组在角膜缝线后第1、3、5、7天，新生血管逐渐增多增长，面积逐渐增大。正常大鼠角膜的蛋白和mRNA中均能检测到HIFla和HIF2a的表达，HIFla和HIF2a的mRNA均表达于角膜组织的各层细胞。大鼠角膜缝线后，HIFla的蛋白表达随角膜新生血管的增多而减少，但对VEGFa蛋白的表达没有影响，HIFlamRNA的表达随角膜新生血管的增多先增加后减少，不仅表达在角膜组织的各层细胞，也表达在新生血管的内皮细胞，但不表达在浸润的炎症细胞；HIF2a的mRNA也表达在角膜组织的各层细胞和新生血管的内皮细胞，也随角膜新生血管的增多

7、先增加后减少，但其蛋白的表达则没有变化。大鼠HIFla存在两个亚型(isoform)，它们的蛋白分子量分别为84和91kDa；HIF2a蛋白的分子量则为96kDa。结论正常大鼠角膜均有HIFltt和HIF2a蛋白和mRNA的表达。正常角膜可能是处于低氧状态。大鼠角膜HIFla蛋白的表达不是随着角膜新生血管的增多而增多，暗示HIFlct不是通过其表达的上调直接促进促血管生成因子的转录而参与新生血管的形成，其功能需要进一步的研究。HIF2ct蛋白的表达不随角膜新生血管的形成而改变，表明HIF2a可能不参与角膜新生血管的形成。关键词：HIFl

8、etHIF2ct角膜新生血管AbstractBackgroundCornealneovascularization(CNV)canreducecornealtransparency,affectvision