人突变型低氧诱导因子1α对大鼠后肢缺血模型血管新生的影响

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1、人突变型低氧诱导因子1α对大鼠后肢缺血模型血管新生的影响【摘要】目的：探讨564与402双位点突变的HIF1α基因(AdHIF1α564Ala402Ala,简称AdH564/402）在大鼠下肢急性缺血模型中的表达及对血管新生的影响.方法：①将先期构建的AdH564/402在HEK293A细胞中进行扩增，用氯化铯浓度梯度离心法进行腺病毒纯化.用电子显微镜、PCR及测序的方法鉴定并用分光光度计法测定病毒滴度；②构建急性大鼠下肢缺血模型，随机分为4组，分别以AdLacZ,AdH0,AdH564/402和

2、生理盐水（NS）转染术侧下肢骨骼肌，于转染后1,3,5,7d，应用RTPCR测定骨骼肌中HIF1αmRNA的表达量；③基因转染后28d，选择性下肢动脉造影及血管铸型观察血管密度.结果：①经扩增、纯化后基因突变区信息保存完好，最终滴度达到（6.29±0.26）×1014OPU（opticalparticleunit,光学颗粒单位）/L.②突变体基因AdH564/402的相对表达量高于野生型HIF1α基因（P=0.000）；且以第7日最高（P=0.000）；经两两比较，不同基因组间及不同转染天数间的表达量均有显著

3、的统计学差异（P=0.000）.③基因转染28d后造影及血管铸型结果显示：AdH564/402组的绒毛小血管数大于AdH0组及其他各组.结论：①外源性突变体AdH564/402基因可促进体内HIF1αmRNA的表达.②外源性突变体AdH564/402基因可促进缺血骨骼肌的侧支血管形成及微血管新生.③突变体AdH564/402基因的生物学功能较野生型基因AdH0更强.【关键词】低氧诱导因子1血管生成逆转录聚合酶链反应动脉造影　　0引言　　人低氧诱导因子1(hypoxiainduciblefactor1,

4、HIF1)是应答细胞氧张力变化的基因表达的重要调节因子［1］，由两个亚单位组成，即氧调节亚单位HIF1α和构成性表达的亚单位HIF1β［2］.HIF1α可调控下游60多种与血管生长、血管张力、糖代谢、红细胞生成及干细胞诱导分化等相关的基因，包括血管内皮生长因子(VEGF)及其受体（Flt1），神经纤毛蛋白1（Neuropilin1）,血管生成素(Ang)1,2,4,血小板衍生生长因子（PDGF）和胎盘生长因子(PIGF)中的其他成员［3］.由于其独特的结构，HIF1α只有在低氧条件下才能发挥功能

5、，其蛋白形式在常氧下5min即发生降解.我们先期对HIF1α的关键位点进行了定点突变，并将其成功包装腺病毒［4-5］.我们将其应用于大鼠下肢急性缺血模型中，观察其对血管新生的影响.　　1材料和方法　　1.1材料564与402双位点突变的人低氧诱导因子1α(AdHIF1α564Ala402Ala,简称AdH564/402)、野生型人低氧诱导因子1α(简称AdH0)及β半乳糖苷酶(βgalactosidase)基因(简称AdLacZ)，均由本课题组构建.RNAisoReagent(TaKaRa公司),

6、TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)，含碘3.5×105g/L的欧乃派克TM（上海安盛药业有限公司），PTPCR仪（FTC2000，上海），NSX6000型数字血管X射线摄影装置（Neusoft公司生产）.HIF1α上游引物：5′TCGACACAGCCTGGATATGA3′；下游引物：5′CGGCTGCGGCCAGCAAAGTT3′.GAPDH上游引物：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′；下游引物：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′.由上海生物工程公司合成.清洁级

7、雄性L，对照组注射等量的生理盐水（NS）.缝合皮肤，继续分笼喂养.　　1.2.4RTPCR测定骨骼肌中HIF1αmRNA的表达于基因转染第1,3,5,7d，过量麻醉处死大鼠，取术侧下肢注射部位的骨骼肌快速液氮冰冻，取80mg在液氮下研碎，用RNAisoReagent提取组织总RNA，反转录合成cDNA，PCR扩增，条件为：95℃预变性5s，95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环.72℃5min,4℃备用.用GAPDH基因作为内对照，RTPCR测定HIF1αmRNA的相对表达量.　　

8、1.2.5大鼠下肢动脉血管造影基因转染后第28日，麻醉大鼠后剖开腹腔，顺行穿刺腹主动脉，用稀释1倍的含碘3.5×105g/L欧乃派克行动脉造影，手推造影剂2～4mL/次，以6幅/s的速度连续摄像记录.以假手术组为阴性对照.　　1.2.6大鼠下肢动脉血管铸型基因转染后第28日，过量麻醉处死大鼠，切开腹腔，暴露腹主动脉，顺行插管固定，分次灌注50g