液体深层发酵培养桦褐孔菌三萜化合物生物合成的研究

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1、摘要桦褐孔菌(1nonotusob均uus)是一种非常珍稀的药用真菌，研究表明其子实体和发酵菌丝体内含有多种生物活性物质，具有广泛的药用开发价值。桦褐孔菌三萜化合物是桦褐孔菌中的一类重要的生物活性物质，它具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、提高免疫等活性。液体深层发酵技术作为现代生物工程的产物有着生产周期短，不受季节气候限制，产物产量高和便于精确控制发酵参数等优点，非常适用于桦褐孔菌三萜化合物的生产。本文在发酵基础培养基上研究了桦褐孔菌液体深层发酵产三萜化合物的动态特性。以发酵菌丝体内三萜化合物总含量为指标，利用统计学的方法优化了液体发酵培养基，通过从

2、子实体分离得到的桦褐孔菌中4种具有代表性的三萜化合物，建立HPLC分析三萜化合物组成的方法。在此基础上比较了优化培养基和基础培养基分别得到的菌丝体和子实体中的三萜化合物总含量和4种主要三萜化合物组成。茉莉酸甲酯(MeJA)作为一种植物信号分子，在植物组织培养中能够诱导次级代谢产物的产生。论文中研究了发酵过程中不同浓度的MeJA和不同助剂对三萜化合物产量的影响，以及不同发酵阶段中MeJA对三萜化合物生物合成的作用，最终建立了一个较为完整的桦褐孔菌三萜类化合物液体深层发酵的体系，取得了较好的结果。1．对桦褐孔菌菌株(1nonotusobliquu

3、sCBS314．39)的原始菌种进行活化纯培养，对Mea平板菌落、菌丝形态进行初步的形态学研究。在发酵基础培养基的基础上考察了生物量，还原糖，pH，三萜化合物总含量等各项发酵参数的变化，确定发酵周期10天。2．利用统计方法对桦褐孔菌液体发酵培养基进行了优化，确定了发酵产三萜化合物的最佳培养基。首先利用单因素试验确定了葡萄糖和混合氮源(蛋白胨+酵母粉)为最优碳氮源，再用部分因子试验设计，筛选出了葡萄糖、蛋白胨、酵母粉及CaCl2对发酵菌丝体内三萜生物合成有显著性影响，最后用响应面法对筛选出的主要因子进行优化，最后通过优化得到培养基最佳组成为(g

4、／L)：葡萄糖58．9，蛋白胨2．9，CaCl20．5，酵母粉1．2，KH2P041．0，MgS040．2。在此培养基条件下，菌丝体生物量达到为8．38g／L，三萜化合物含量提高N57．1mg／g，且相对优化前三萜化合物含量41．8mg／g提高T36．6％，比天然子实体中三萜化合物含量36．3mg／g提高T57．3％。同时对三种条件下桦褐孔菌中4种主要三萜化合含量进行了分析，结果显示除羊毛甾醇外，发酵菌丝体的三萜含量均高于野生子实体，且优化培养基中茵丝体内4种三萜含量与基础培养基的有显著差异。优化条件下四种三萜化合物，栓菌酸、白桦脂醇、桦褐孔

5、菌醇和羊毛甾醇的含量分别达到1．72mg／g，3．23mg／g，4．02mg／g和0．50mg／g。3．通过从子实体中分离得到了四种主要的三萜化合物，并通过结构分析确定为栓菌酸、白桦脂醇、桦褐孔菌醇和羊毛甾醇，并以它们为标准品建立了分析桦褐孔菌中四种三萜化合物组成准确可靠的HPLC分析方法。4．重点研究了MeJA对桦褐孔菌中三萜化合物生物合成的影响，结果表明：MeJA对三萜合成具有显著的诱导作用，以吐温．20为助剂时500M的MeJA效果最好，三萜化合物含量达到最大值57．4mg／g。且在不同发酵阶段诱导三萜合成的效果不一样，在发酵初期阶段加

6、入，对菌丝体生长具有明显抑制作用，在发酵后期诱导三萜合成作用不明显，在菌丝体对数生长期(第6天)MeJA诱导作用最显著，三萜总含量达到了最大值63．1mg／g，比对照组(第10天)41．2mg／g提高了53．2％。但比较四种主要三萜化合物的含量变化，发现它们出现最大诱导合成的时间出现了先后差异。关键词：桦褐孔菌、三萜化合物、响应面法、茉莉酸甲酯、液体深层发酵IIThestudyontriterpenoidsbiosynthesisbyInonotusobliquussubmergedfermentationAbstractInonotusob

7、l{qtltlsisarareedibleandpharmaceuticalfungus．Thefruitbodyandmyceliumoflnonotusobliquuscontainsmanykindsofbioactivesubstances，thusthefungushasahighvaluetobeemployed．1nonotusobliquustriterpenoidsareimportantbioactivitysubstanceswithantiviral，anti-inflammatory,immunomodulatory

8、activites．SubmergedfermentationisexpectedtobeasuitabletechnologytoproductInonotuso