新加良附方对移植性小鼠肝癌抑制率及其凋亡影响研究

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1、http://www.paper.edu.cn新加良附方对移植性小鼠肝癌抑制率及其凋亡影响研究112雒琳马成杰陈信义1北京中医药大学东直门医院肿瘤血液科，1007002教育部、北京市重点实验室（中医内科学），100700E-mail:chenxinyi0729@sohu.com摘要：目的：观察新加良附方对移植性小鼠肝癌（H22）生长抑制作用及其对肿瘤组织中Bcl-2和Bax表达的影响。方法：建立移植型H22动物模型，并将动物模型随机分为模型对照、环磷酰胺（CTX）与及新加良附方大、中、小剂量5组。新加良附大、中、小剂量组

2、给药量分别为10g/kg、5g/kg和2.5g/kg；CTX组给药剂量为17mg/kg；模型组给予等量无菌生理盐水。连续给药、给水12天处死模型小鼠分离肿瘤，检测肿瘤大小、称重计算肿瘤抑制率，并将肿瘤组织切片，免疫组化法检测Bcl-2和Bax基因。结果：新加良附大剂量组肿瘤抑制率为48.5％，与模型对照组比较，有统计学意义（P＜0.01）；新加良附大、中剂量可降低肿瘤组织中Bcl-2蛋白基因表达，升高Bax蛋白基因表达，与模型组比较，有显著性差异（P<0.01，P＜0.05）。结论：新加良附方可抑制H22瘤体生长，并能下

3、调Bcl-2蛋白基因表达，上调Bax基因。预示新加良附方在抗肿瘤方面具有进一步深入研究价值。关键词：新加良附方；H22肝癌细胞；抑瘤率；凋亡基因新加良附方由《良方集腋》中的良附丸加味而来，主要成分为高良姜、香附和穿山龙，处方中单味药均有抗癌作用的文献报道，如穿山龙粗提物及薯蓣皂苷元体外实验对多种肿瘤[1,2]细胞均有明显抑制作用；姜黄素对肝癌细胞的体外抑制作用达到70％以上，而且姜黄素[3]能显著延长荷瘤大鼠的生存时间；在缺氧条件下，姜黄素通过抑制肝癌细胞EEL-7402中[4]VEGF的表达来抗肝癌血管形成、抑制肝癌细

4、胞的生长和转移；高良姜主要化学成分槲皮素有抑制多种肿瘤细胞的增殖，促细胞分化，诱导细胞凋亡，抗氧化，清除自由基等多种抗肿[5][6]瘤作用；香附水提液对小鼠肉瘤腹水型肿瘤细胞生长率有较强的抑制作用。为进一步了解复方抗癌活性，我们选用实体型肝癌H22小鼠模型，以抑瘤率为指标观察新加良附方的抗肿瘤作用，并对其诱导小鼠肝癌H22细胞凋亡进行初步研究。1材料1.1动物与细胞系选用健康昆明种小鼠50只，体重18～22g，雌雄各半，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供（合格证号：SCXK-（军）2002-001）；小鼠肝癌

5、（H22）肿瘤细胞系由中国人民解放军军事医学科学院动物实验中心提供。1.2药物与试剂按照中药新药药效学研究规范研制的新加良附方，褐色粉末浸膏由北京博诺瑞特科技发展有限公司与西安星华药物研究所无偿提供；环磷酰胺（CTX）由江苏恒瑞医药股份有限公司生产（批号：06052021）；Bcl-2（批号：SC-783）和Bax（批号：SC-52）单克隆抗体均1PDF文件使用"pdfFactoryPro"试用版本创建www.fineprint.cnhttp://www.paper.edu.cn由美国Zymed公司生产；免疫组化染色试剂

6、盒PV6001由美国Zymed公司生产。2方法2.1建立肝癌模型无菌条件下取接种传代7天的腹水型H22小鼠腹水，用1:2生理盐水稀释成细胞悬液，7使细胞总数约1×10个/ml，每只小鼠右腋皮下接种0.2ml。2.2分组与给药小鼠接种H22瘤细胞24h后，按体重随机分为模型对照、环磷酰胺（CTX）与及新加良附方大、中、小剂量5组。新加良附大、中、小剂量组均灌胃给药，剂量分别为10g/kg、5g/kg和2.5g/kg；CTX组以17mg/kg腹腔注射；模型组给予等量无菌生理盐水。分组后连续给药、给水12天。2.3肿瘤抑制率计

7、算停药、停水后次日处死小鼠，剥瘤称重，计算各组抑瘤率。抑瘤率计算公式：抑瘤率＝（对照组平均瘤重－实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100％。2.4凋亡基因蛋白表达将剥取的瘤块标本用10％甲醛固定，固定的标本进行脱水，常规石蜡包埋，于肿瘤最大切面组织块处制作4μm的连续切片，免疫组化染色。免疫组织化学染色采用二步法，石蜡切片常规脱蜡至水，封闭内源性过氧化物酶活性后，室温下将标本与1：50稀释的一抗孵育3h，PBS冲洗后加入二抗孵育30分钟，PBS冲洗后即加入DAB显色。使用美国Image-ProPlus5.0图像分析软件分

8、析计算阳性细胞IOD值。2.5统计方法采用统计软件包SPSS13.0版统计实验资料。计量资料以均值±标准差（x±s）表示；多组间比较用方差分析，再用LSD法进行组间两两比较。当P<0.05时被认为有统计学意义。3结果3.1肿瘤抑制率实验各组瘤重及抑瘤率见表1。表1.各组瘤重与抑瘤率的比较（X±S）组别动物（只）瘤重（