槐耳清膏诱导肝癌小鼠移植瘤细胞凋亡的实验研究

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1、第二军医大学硕士学位论文槐耳清膏诱导肝癌小鼠移植瘤细胞凋亡的实验研究姓名：刘学军申请学位级别：硕士专业：中西医结合临床指导教师：凌昌全20090501槐耳清膏诱导肝癌小鼠移植瘤细胞凋亡的实验研究摘要【背景】原发性肝癌(PLC)已成为我国第二位恶性肿瘤病因，是最常见的恶性肿瘤之一。统计资料表明，全世界每年新发肝癌病例约45％在我国大陆。近20年来，我国肝癌死亡率增加了41．7％，可见我国肝癌高发的趋势已十分严峻【ll。研究发现，中医中药配合各种西医常规方法治疗中晚期原发性肝癌，具有明显改善临床症状及体征，提高生存质量，延长生存期等作用【舶。近年来，加大

2、了对中药的开发力度，从中药中筛选提纯出有形成份，如中药多糖，进行抗肿瘤实验，取得了一定的进展，为中药抗癌提供了一条途径。槐耳是生长在老龄中国槐树干上的一种药用真菌一一槐栓菌(TrametesrobiniophilaMurr)，其主要抗癌活性成分为蛋白多糖(PS-T)。现已有其成品——金克槐耳颗粒(国家一类新药)应用于临床。综合现代文献报道，槐耳颗粒在临床上已广泛应用于多种肿瘤的治疗，并取得了一定的疗效：l、消化系统肿瘤：槐耳配合常规化疗方案，能显著提高胃癌术后的5年生存率131；槐耳配合化疗能提高大肠癌术后患者的免疫功能，减轻化疗毒性，改善造血功能Ⅲ

3、；2、呼吸系统肿瘤：槐耳能显著改善非小细胞肺癌患者的免疫功削5J；3、血液肿瘤方面：单用槐耳治疗慢性粒细胞性白血病的总有效率可达80％【61；4、其它肿瘤：槐耳对乳腺癌肿瘤【7】也有良好的疗效。在阐述其抗肿瘤机制方面，也有进行了大量的实验研究。目前已有的槐耳作用于肝癌的基础实验表明，槐耳在体外可直接作用于肝癌细胞并诱导其凋亡【8】，本实验将在此基础上，进一步研究槐耳诱导肝癌细胞凋亡的作用。【目的】1、体外观察槐耳清膏对人肝癌SMMC．7721细胞株的生长抑制作用；2、观察槐耳清膏对肝癌小鼠移植瘤细胞的抑制作用，并初步探讨其作用机制。【方法】1、MTT

4、法检测槐耳清膏在体外对肝癌细胞SMMC．7721细胞株的抑制率；2、观察槐耳清膏对小鼠移植瘤的抑制作用及其诱导凋亡作用皮下注射H22小鼠肝癌细胞，造荷瘤小鼠的模型，分为A组(空白对照组)、B组(5．Fu组)、C组(槐耳清膏组)、D组(槐耳清膏+5．Fu组)，用药结束后，称瘤重，计算抑瘤率；HE染色，观察瘤组织的病理学改变；TUNEL法检测各组肿瘤组织凋亡率；用免疫组织化学的方法检测移植瘤细胞组织相关凋亡蛋白Bcl．2、Bax的表达，初步探讨其诱导凋亡的可能机制。【结果】第二军医大学硕士学位论文1、体外抑制细胞增殖实验：槐耳清膏对肝癌SMMC．7721

5、细胞有明显的抑制作用，且随浓度增加而上升，呈剂量．效应关系，10mg／ml槐耳清膏组与5mg／ml槐耳清膏组的48h抑制率分别达到65％和55％。2、体内抑制肿瘤生长实验：A组(对照组)荷瘤小鼠移植瘤重量明显大于B组(5一Fu组)、C组(槐耳清膏组)和D组(槐耳清膏+5．Fu组)(P<0．05，P<0．05，P<0．05)，B，C，D组抑瘤率分别为31．2％，27．1％，47．5％，提示槐耳清膏在体内具有抑制肿瘤生长的作用；且D组抑瘤率明显高于B，C组，差异有统计学意义(尸．

6、、TUNEL法肿瘤组织细胞凋亡率的检测显示，凋亡率由高到低依次为：槐耳清膏联合5．Fu组、槐耳清膏组、5．Fu组、对照组，差异有统计学意义(氏0．05)。4、相关凋亡蛋白Bcl-2的测定，免疫组化结果显示：对照组的Bcl-2阳性表达率为43．02--t=2．05％，明显高于5．Fu组、槐耳清膏组、槐耳清膏联合5．Fu组的阳性表达率，差异有统计学意义(砌．05)，表明槐耳清膏可下调荷瘤小鼠瘤组织细胞Bcl．2蛋白的表达。5、相关凋亡蛋白Bax的测定，免疫组化结果显示：槐耳清膏联合5．Fu组的Bax阳性表达率87．88=t=9．72％，高于对照组、5．F

7、u组、槐耳清膏组，差异有统计学意义俨<0．05)I对照组与槐耳清膏组的差异没有统计学意义(胗O．05)，表明槐耳清膏联合5．Fu可增强Bax蛋白的表达。【结论】1、槐耳清膏在体外对肝癌SMMC．7721细胞有抑制其生长的作用；2、槐耳清膏在体内可通过诱导凋亡抑制小鼠移植瘤生长；3、槐耳清膏可下调Bcl．2基因蛋白表达，联合5．Fu上调Bax基因蛋白表达作用明显，认为槐耳清膏可能通过诱导荷瘤小鼠移植瘤组织细胞凋亡，抑制肿瘤生长。【关键词】肝癌，槐耳清膏，诱导凋亡，Bcl．2，Bax．2．BACKGRoUND：AbstractPrimaryliverca

8、ncer(PLC)hasbecomethesecondcauseofmalignanttumors，whic