低温胁迫白灵菇原基形成过程中DNA甲基化变异及调控基因研究

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1、分类号：单位代码：10193密级：学号：20140833博士学位论文低温胁迫白灵菇原基形成过程中DNA甲基化变异及调控基因研究DNAMethylationVariationandRegulatorygenesResearchDuringthePleurotustuoliensisPrimordiumFormationInducedbyLowTemperture作者姓名：华霜学位类别：博士学位专业名称：菌类作物研究方向：菌类作物栽培与育种指导教师：李玉教授所在学院：农学院2017年12月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的

2、成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留

3、送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要白灵菇（Pleurotustuoliensis），是中国具有自主知识产权及确切来源的食用真菌品种之一，它主要分布在世界上的亚洲及南

4、欧地区。白灵菇作为一种新兴的珍稀食药用菌品种受到广大群众的喜爱。据报道，新疆是我国的最早驯化栽培的地方，例如裕民、托里、青河等地区。白灵菇的生长发育过程中的催蕾阶段是必须要经过低温和温差刺激的，故它属于中低温型变温结实食用菌，没有低温阶段则不能促使原基分化和菇蕾形成，生长发育过程的这一特质已然成为白灵菇产业化栽培发展的重要突破点。本实验旨在开展白灵菇低温胁迫处理过程中DNA甲基化调控机理的研究，为白灵菇育种提供理论依据和实验指导。本文选取低温胁迫诱导条件下不同发育时期白灵菇为实验材料，利用甲基化敏感多态性扩增（MSAP）技术研究了低温处理诱导的白灵菇基因组DNA甲

5、基化的水平和高/低甲基化模式变化，并通过重亚硫酸氢盐高通量（Bisulfite-sequencing，BS-seq）全基因组测序技术研究DNA甲基化的基序分布和调控作用。主要研究结果如下：1.MSAP分析方法的建立利用三种方法提取白灵菇基因组，结果表明改良的CTAB法提取的基因组质量较好。通过设计单因素和正交试验，发现37℃下进行双酶切5个小时为最佳酶切时间，选择16℃连接过夜（即12h）反应比较合适；预扩增产物选用10倍的稀释度为连接产物的稀释倍数。依据预扩增产物在1%琼脂糖凝胶呈弥散分布的原则，直观预扩增产物电泳图，同时节俭考虑最佳使用量为准，故选择预扩增PC

6、R反应体系确定为10×PCRBuffer2.5μL，dNTP2.5mmol·L-11.0μL，Primer200ng·μL-11.5μL，Taq聚合酶0.2μL，DNA模板2.0μL。2.低温胁迫诱导白灵菇不同生长发育时期DNA甲基化的变化利用优化的MSAP方法研究低温胁迫诱导白灵菇不同生长发育时期的甲基化，首先从420对引物筛选出条带数目多且清晰的100对引物，扩增产物共产生2060条带，得到结果为25℃时甲基化水平为24.3%，在4℃低温胁迫处理3天后，甲基化水平变为32.2%；菌丝扭结期，甲基化水平为最高41.4%；子实体形成后，甲基化水平降为38.7%。D

7、NA甲基化模式分析结果为：CG和CHG甲基化位点的甲基化降低变异频率没有他们相应的甲基化升高的变异频率高；CG位点的变异频率要高于CHG位点的变异频率。3.不同低温胁迫诱导白灵菇DNA甲基化变异序列的相关基因功能分析研究发现，低温处理后体现出略高的DNA甲基化修饰，full-methylated水平一直显著高于hemi-methylated水平，full-methylated在12.62%到19.10%之间，hemi-methylated在3.84%到9.21%之间。低温刺激使CGhypermethylation产生了更大的变化，而CGhypo-变I化量最少。在对

8、相关基因的