苹果愈伤组织形成过程中DNA甲基化的研究.pdf

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1、万方数据ResearchofDNAmethylati0IIduringtIIe10rmation0IcawintlUcetllromJ1p--n'l··''6apple(Malusdomestica)leavesThesissubmittedtoqingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofScienceLvXiaoting(DepartmentofLifeScience)Supervisor：WangAihuaQingdao．Chi

2、naJune，2012独”峥明㈣螋万方数据而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明研究生签名：时间：≯fy／、年口月；D日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：导师签名：时间：≯fV年／月知日时间：wfL年Z月弓阳万方数据青岛农业大学硕士学位论文中文摘要苹果愈伤组织形成过程

3、中DNA甲基化的研究摘要本研究选用‘嘎啦’苹果叶片及其诱导产生的愈伤组织为材料，利用MSAP标记分析愈伤组织形成过程中DNA甲基化的动态变化规律，研究DNA甲基化在愈伤组织形成过程申的作用，从分子水平解析愈伤组织形成的机制。主要结果如下：1适宜培养基的筛选以‘嘎啦’苹果组培苗为材料，实验获得适合‘嘎啦’苹果组培苗继代增殖的培养基：MS+BA2．omg／L+NAA0．1mg／L，适合‘嘎啦’苹果组培苗壮苗的培养基：MS+BA0．8mg／L，在该体系下建立单芽系组培苗，以保证后续实验遗传背景一致。并用该单芽系叶片在Ms+NAA0．5mg／L+BA2．

4、0mg／L+2，4一D2．0mg／L培养基中诱导愈伤组织。25一azaC对愈伤组织形成的影响在筛选获得的愈伤组织诱导培养基中，分别添加浓度0、0．01、0．1、1、10、100、500umol／L的5-azaC。以叶片为外植体，接种后置于温度26℃的培养室暗培养。结果表明：低浓度的5-azaC(0．01、0．1、1、10umol／L)处理对愈伤组织的形成没有显著影响，100“mol／L5-azaC处理的愈伤组织形成时间比对照组提前3d，而高浓度500“mol／L处理中，外植体在愈伤组织诱导的2-3d左右开始出现泛黄现象，最终干枯死亡。3苹果MSA

5、P实验体系的优化与建立以源于同一单芽系苹果组培苗的叶片诱导获得的的愈伤组织为材料，提取基因组DNA，优化并建立了MSAP实验体系。其中双酶切体系中舍DNAlug；EcoRI，HapII或MspI各10U；37℃孵育12h。20“L预扩增体系：酶连产物1uL、上下游引物各3HL、2×PCRm8stermix10uL(Taq酶1U、dNTPs5mM、M92+30mM)、ddH203“L。20uL选择性扩增体系，含60倍稀释的模板DNA2uL、上下游引物各3uL、2xPCRm8stermix10“L(Taq酶1U、dNTPs5mM、Mg”30mM)、d

6、dH202“L。用该体系，可获得清晰的特异性银染指纹图谱，以进行DNA甲基化的模式分析。4愈伤组织形成过程中DNA甲基化的MSAP分析利用2个EcoRI和8个SpaⅡ／gspI引物组合成16对引物，对叶片、培养4d、8d、12d、16d形成的愈伤组织、继代愈伤组织和经5-azaC处理产生的愈伤组织的基万方数据青岛农业大学硕士学位论文中文摘要因组DNA进行了MSAP分析，共扩增出2284条特异性条带。其中，叶片(对照)、4d、8d、12d、16d、继代愈伤组织、经5-azaC处理产生的愈伤组织所能检测出的DNA甲基化住点数分别为444、402、29

7、4、263、348、256和337个。愈伤组织的甲基化程度(39．5％)高于叶片的甲基化程度(27．3％)，愈伤组织的甲基化以半甲基化为主，占总甲基化的70．3％。在愈伤组织形成过程中，DNA甲基化水平呈现先降低后升高的趋势。并且甲基化和去甲基化现象同时存在共同作用，最终使愈伤组织的基因组甲基化水平升高。5特异性条带的类型及回收实验获得的多态性条带共表现出三种类型，一是从叶片到愈伤组织，带逐渐消失；二是从叶片到愈伤组织，带逐渐出现；三是从叶片到愈伤组织，带先出现又消失。这表明在愈伤组织形成过程中，不同位点DNA甲基化变化规律不同，部分位点DNA甲

8、基化水平在该过程升高，部分位点则降低，表现出位点特异性。选取42条特异性条带进行回收并测序，获得两条基因序列，其功能还有待于进一步研究。