愈伤组织培养.pdf

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1、第三章愈伤组织培养•主要内容:•材料的制备•愈伤诱导与分化•形态发生•愈伤的培养第一节植物材料（外植体）的制备1.一般植物组织都能诱发愈伤组织。:诱导愈伤组织的成败关键主要不是实验材料，而是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。双子叶植物为最多，单子叶植物(1990’s)，此外，裸子植物、蕨类和藓类植物也有诱发成功的例子。2.材料必须完全无菌微生物一旦与培养基接触，就迅速繁殖，抑制愈伤组织的生长。用抗菌素来抑制微生物的生长，在短时间有效，而且抗菌素只能对一定谱系中的细菌才产生作用，该谱系以外的微生物仍然可以大量繁殖。抗菌素还可能抑制

2、植物组织的生长。得到无菌材料，植物组织必须先进行消毒。有好几种化学试剂都能起到表面消毒的作用，试剂的选择及处理时间的长短要根据材料对试剂的敏感性来决定。一般都采用在消毒后能很容易去除的药剂。因为消毒剂对植物细胞也有杀伤作用，若不去除就会妨碍愈伤组织的发生。例如用无菌水反复冲洗后可以把大部分药剂都洗掉，或者能自动分解变成低毒性物质。本氯酸钠能分解成为具有杀菌效能的氯气，然后就散失到空气中。低浓度的氯化汞是一种令人满意的消毒剂，只是难以去除，故在消毒后必须用大量清水冲洗材料。在材料放入消毒剂之前，先在乙醇中漂洗一下，可以使材料表面弄湿，从而使消

3、毒剂易于渗入并杀死微生物。3.外植体的大小和形态消毒后的植物材料，即可进行培养。从外表均一的外植体长出的愈伤组织，在开始阶段是相当一致的，而从茎、根等器官切段上长出的则是一个混杂的愈伤组织。有些外植体外表上看来是由同一类细胞组成，例如烟草的髓、胡萝卜的次生韧皮部、菊芋的块茎等，这些细胞中DNA的含量有很大差别。这种差别可能是由于细胞核中染色体数目的差别，即倍性不同所造成的。接种的外植体的大小和形状并不需要严格限制不能太小，小于肉眼能见的限度时，细胞分裂可能难以发生。故一般要求切块的大小要适当。外植体的细胞数目多，获得愈伤组织的机会也多。如果

4、目的仅在于得到愈伤组织，那末将茎的切段、叶、根、花、果实或种子，或其中的某种组织切成一片片或一块块放到培养基上就可以了。如果要定量地研究愈伤组织的发生，那末外植体的大小必须一致，形状和组成也要基本相同。进行这类研究常选用组织块较大的材料，例如胡萝卜的贮藏根、马铃薯的块茎、菊芋、荷兰防风草等。这样才能得到足够数量的、无菌的、一致的、适合于培养的外植体。具体的操作过程：无菌的块茎或块根，用钻孔器钻出一批同一类薄壁组织圆柱形的组织，平行排列好。多把刀片等距离地固定在一组金属片之间，一次切下去得到许多个长短一致的圆柱形的外植体。圆柱形大量地、准确地

5、得到外形相同的外植体。圆柱体的表面积大，利于组织块和外界气体和营养物的交换。外植体的损伤表面分泌物，具有促进愈伤组织形成的能力，因此表面积越大，产生分泌物数量也越多，愈伤组织的得率也越高。外植体的体积应尽可能小，从而得到较大数量的外植体。外植体最小的限度由其亲本组织细胞的平均大小来决定。细胞数目。例如菊芋的细胞比胡萝卜根次生韧皮部的细胞大三倍，一个3.8毫克的胡萝卜外植体大约包含25，000个细胞，这样一个外植体是能够成活的。而同样重量的菊芋外植体，由于细胞大而数目少，在分离过程中造成损伤往往难以成活。必须重量达到8毫克才包含约20，000

6、个细胞，使之易于成活。第二节愈伤组织的培养一、培养基培养基一般包括大量元素、微量元素和一种碳水化合物，最常用的碳水化合物是蔗糖。这样简单的培养基(基本培养基)只有很少几种植物组织能够培养和维持下去，大多数组织需要添加各种各样的附加物（完全培养基），如维生素、氨基酸、糖醇，生长素、细胞分裂素、赤霉素、螯合剂如EDTA、各种营养性的提取物如椰子汁等。注意：选用完全已知的合成化合物，不大主张用复杂的天然产物，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。必须强调：适合于诱发愈伤组织的培养基不一定适合于维持这些愈伤组织；适合于液体培养的培养基也不一定适合于固体培

7、养。培养基中的N，大多数都用硝态氮，只有MS培养基和B5培养基中才用硝态和铵态的混合物。K的水平在近代的培养基中有逐渐提高的趋势。有趣的是，各种离子浓度大为不同的培养基往往能使相同的组织快速生长。例如Hildebrandt培养基与MS培养基显著不同，但二者都能培养烟草的愈伤组织。•注意：•激素的种类和用量的添加•一般诱导愈伤常添加2.4-D二、愈伤的培养方式：培养分为固体和液体培养两大类。液体培养又分静止和振荡培养的二类。l继代培养（传代）：愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于养分的枯竭，水分的散失，组织代谢产物的积累，影响愈伤组织生长，

8、因此必须将组织转移到新的培养基上。一般在25-28℃下进行固体培养时，每隔4-5周进行一次继代培养。组织块较小时，继代培养时可将整块组织转移。组织块较大时，可先将组织分成几小块再