低温胁迫下活性氧对斑马鱼ZF4细胞基因组DNA甲基化水平的影响

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1、学校代码：10264研究生学号：M150110198上海海洋大学硕士学位论文低温胁迫下活性氧对斑马鱼ZF4细胞题目：基因组DNA甲基化水平的影响Effectsofreactiveoxygenspeciesonge-英文题目：nomicDNAmethylationofzebrafishZF4cellsunderlowtemperaturestress专业：生物学研究方向：分子生物学姓名：侯艳雯指导教师：张俊芳二O一八年月日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下

2、，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学

3、位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注上海交通大学医学院附属仁洪洁教授/博导主席济医院中国科学院上海生命科学研魏刚研究员/博导委员究院副研究员/硕韩兵社上海海洋大学委员导罗军涛上海市第六人民医院东院硕士秘书答辩地点水产与生命学院A211答辩日期2018.5.25上海海洋大学硕士学位论文低温胁迫下活性氧对斑马鱼ZF4细胞基因组DNA甲基化水平的影响摘要低温压力会导致鱼类生理功能失调、机体损伤甚

4、至死亡，鱼类会产生各种适应性变化来应对低温压力，其中涉及到的表观遗传学机制越来越受到重视。在课题组之前的研究中，我们对比了生活在寒冷地区的南极鱼和多种温带硬骨鱼的转录组和基因组，发现活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）代谢相关通路中的基因表达水平在南极鱼中显著上调。进一步研究发现，低温胁迫能够诱导斑马鱼(Daniorerio)ZF4细胞系中ROS的产生，并且ROS水平取决于低温压力的强度和持续时间。此外，前期研究发现，斑马鱼ZF4细胞整个基因组DNA甲基化水平在短期低温胁迫（18℃5d）下显著上升，而在长期

5、低温胁迫（18℃30d）下甲基化水平反而下降。然而低温胁迫下，DNA甲基化与活性氧之间的关系尚未研究清楚。本研究利用斑马鱼ZF4细胞系作为研究材料，对其进行短期低温胁迫：18℃3d、18℃5d、10℃3d、10℃5d，以及长期低温胁迫：18℃30d。与之同时在显微镜下观察细胞生长状态，并计算细胞比生长率。然后用甲基化敏感酶HpaII及其甲基化不敏感同切点酶MspI对细胞基因组进行酶切，计算酶切比例，探测DNA甲基化水平的变化。另外，用抗氧化剂N乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine，NAC）或者共济失调–毛细血管扩张突变（

6、ataxiatelangiectasiamutated，ATM）抑制剂KU-55933预处理细胞，Westernblot检测γH2A.X的表达量变化以及酶切检测DNA甲基化水平的变化。结果如下：1)低温胁迫使得细胞的形态发生改变：正常培养温度下（28℃）ZF4细胞呈不规则三角形，细胞核为卵圆形，胞质突起，细胞边缘清晰。在18℃低温处理5d后，细胞形态无显著变化，但有少量细胞脱落。在18℃低温处理30d后，可以看见细胞边缘模糊，大部分细胞不再是不规则三角形，细胞核形态不规则。在10℃处理处理3d后，ZF4细胞形状从不规则三角形收缩为

7、长条状，细胞间空隙变大，部分细胞死亡。而在10℃处理5d后，I上海海洋大学硕士学位论文细胞大量死亡漂浮在培养基中。通过检测细胞比生长率发现，28℃细胞以及18℃下处理30d的细胞在接种后4-5d都能达到最大比生长速率，分别为0.568和0.355。而18℃下短期处理的细胞贴壁后第1d有部分细胞死亡，比生长速率为负，之后的第2-7d比生长速率也较低，在0.06左右。2)低温胁迫处理后，与28℃下培养的细胞相比，无论是在18℃还是10℃，短期低温压力都能导致细胞基因组DNA甲基化水平显著上升，而在18℃低温处理30d后，细胞基因组DN

8、A甲基化水平明显下降（P<0.05）。3)在18℃和10℃处理3d的情况下，用NAC预处理的细胞相比于对照组，其γH2A.X蛋白表达量明显下降，并且18℃3d和5d的ZF4细胞预处理NAC后，相对于未加药组其基因组DNA甲基化水平显著下降（P<0.