hbv启动子调控肝细胞高表达载体构建及抑癌作用的研究

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5、塑主兰竺丝兰一——————土至壁墅!一皿v启动子调控的肝细胞高表达载体构建及抑癌作用研究摘要肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，每年使大约100万例病人死亡，尽管目前肝癌的治疗方法很多，但仍未能从根本上改变病人的预后。近年来肝癌的基因治疗已经成为生物医学和临床医学研究的热点。肝癌基因治疗的靶向性调控，即调控目的基因特异性导入肝癌细胞或在肝癌细胞中实现特异性表达，最大限度的杀伤肝癌细胞的同时而不损伤正常肝细胞，已成为决定基因治疗效果及可行性的关键因素。分子病毒学研究揭示了HBV的表达调控机制，为利用HBV嗜肝细胞基因表

6、达调控特性构建肝细胞特异表达载体提供了条件。船V基因组仅有3．2kb，结构紧密，所有调控序列均位于蛋白编码区。HBV3．5kb、2．4kb、2．1kb和O．9kb的RNA转录物的起始点附近各有一个启动子，分别为c、sPI、SPII和x启动子。另外在1074～1234位核菅酸和162弘1774位核苷酸处有HBV的两个增强子ENI和ENII。该两段序列具有高度保守性，并在其上有多个肝特异转录因子的结合位点，与ENI结合的转录因子有肝细胞特异性的C，EBP、}Ⅱ虾4和衄lF，与ENII相结合的肝细胞蛋白因子有C但B

7、P、m盯．4、HLF、}ⅡqF3、F1下和E4BP4等。由于与}ⅢV的启动予和增强子特异结合的转录表达调控因子几乎只存在于肝细胞中，而不存在于其它细胞中，决定了肝细胞增强子ENI和ENII具有高度肝细胞专一陛，其对HBV在肝细胞中的特异表达有相当重要的贡献，并在一定程度上决定了HBv的嗜肝

8、生。因此，以HBV病毒嗜肝细胞表达密切相关的启动子、增强子为表达调控元件构建肝细胞特异表达载体携带只对肿瘤细胞起抑制或促调亡作用的治疗基因导入人体后，便可达到杀伤肝癌细胞而对正常肝细胞或非肝细胞无影响的目的，充分体现了基因

9、治疗的优势。据此，本论文拟进行以下研究：(1)克隆不同的HBv启动子片段，评价其在肝细胞和非肝细胞中的转录活眭。筛选出在肝细胞中特异性表达最强的DNA序列组合形式。(2)构建HBV启动子调控的外源端粒酶hn盯反义RNA、印opt抽、IL一24和OSM基因载体，并检测各种治疗基因在体内外的抑癌作用。婴主兰篁笙奎一一——————』兰兰塑兰一主要工作及结果概述如下(一)肝细胞特异表达载体的构建1．构建了受