巨噬细胞特异性启动子调控的真核表达载体的构建及靶向性研究

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1、巨噬细胞特异性启动子调控的真核表达载体的构建及靶向性研究【摘要】目的:构建巨噬细胞特异性启动子调控的靶向巨噬细胞的真核表达载体。方法:PCR方法合成巨噬细胞特异性启动子,并将其插入带有绿色荧光蛋白（GFP）基因的真核表达载体pEGFPN1中,替代CMV启动子。利用脂质体转染法,将其与红色荧光蛋白真核表达载体（pERFPN1）共转染巨噬细胞和非巨噬细胞,通过荧光显微镜观察GFP和RFP在不同细胞中的表达水平来鉴定启动子的靶向性。结果:成功构建了巨噬细胞特异性启动子调控的真核表达载体,并且能在巨噬细胞中高效特异性地表达报告基因。结论:构建的靶向巨噬细胞的真核表达载体能提高目的基

2、因的表达特异性,为提高基因治疗胞内菌感染的靶向性及降低毒副作用奠定了实验基础。【关键词】巨噬细胞细胞特异性动子真核表达载体胞内菌感染基因治疗胞内菌感染的治疗一直是临床上棘手的问题之一。常见的胞内感染细菌主要有结核杆菌、伤寒沙门氏菌等。这些胞内感染菌突破人体第一道防线后,在体内首先遇到巨噬细胞的吞噬和杀灭。然而在很多情况下巨噬细胞虽能吞噬这些细菌,却并不能彻底杀死它们,反而变成了胞内菌的庇护所[1]。另外,由于大多数抗菌药在细胞内的浓度低,导致胞内菌不能被有效杀灭,而且胞内菌感染的治疗疗程长,8容易导致毒副反应的发生和耐药性的出现,更使其治疗困难[2]。因此,针对胞内菌感染的治疗

3、,新型抗菌药物和治疗方法的开发及应用显得尤其重要。我们前期成功构建了抗菌肽基因的真核表达载体,并在小鼠巨噬细RAW264.7中成功表达了抗菌肽,发挥了杀灭胞内菌的作用(待发表)。但是由于抗菌肽具有一定的毒副作用,会对机体正常细胞产生损伤作用。为了减少抗菌肽对机体正常细胞的毒副作用,增强目的基因表达的特异性和基因治疗的靶向性,本研究中我们构建了巨噬细胞特异性启动子调控的靶向巨噬细胞的真核表达载体,并利用绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）作为报告基因研究了该启动子在不同种类细胞中表达的特异性。　　1材料和方法　　1.1材料　　真核表达质粒pEGFPN1和pERFPN

4、1为Clontech公司产品。大肠杆菌DH5α由本室保存。高保真聚合酶、逆转录酶、连接酶、DNAmarker等购自大连TaKaRa公司。限制性内切酶VspI和KpnI购自上海生工生物有限公司。胶回收试剂盒、质粒提取和RNA提取试剂盒购自上海华舜公司。Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。RPMI1640和DMEM培养基购自Gibco公司。其他试剂为国产分析纯试剂。小鼠巨噬细胞株RAW264.7、人结肠癌细胞株Lovo、8人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株ZR7530、非洲绿猴肾细胞株COS7均由本室保存。　　1.2方法　　1.2.1引物的设计

5、与合成及巨噬细胞特异性启动子的拼接合成根据GenBank（登录号:DQ107382）和参考文献[3]报道的巨噬细胞特异性启动子序列设计拼接引物,序列为P1:5′GGCGCATTAATAAGCGACTTCCTCTTTCCAGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCCAAGATTTCCAAACTCTGTGGTTGCCTTG3′,P2:5′ACGAGCTCCTACTTCTCCTTTTCTGCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTCAAGGCAACCACAGAGTTTGG3′,P3:5′ACGAGCTCCTACTTCTCCTTT

6、TCTGCCAAGATTTCCAAACTCTGTGGTTGCCTTG3′,P4:5′CTTCTCCTTTTCTGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCAAGGCAACCACAGAGTTTG3′,P5:5′CTTTTCTGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTTACCCTCCC3′,P6:5′GAGGAAGTCGCTTTTGTCGCGGTCGGGACAGGGGGCAGGGAGGGTAAAGCGACTTCC3′,P7:5′8GCGACAAAAGCGACTTCCTCTTTCCAGTGCATTTAAGGCGCAG

7、CCTGGAAGTGCCAGG3′,P8:5′GGGGTACCGCTAGCGACTGGGTGGCCTCCAGTGCTCCCTGGCACTTCCAGGCTGCG3′。其中划线处分别为为VspI和KpnI的酶切位点,引物由上海生工生物有限公司合成。以P1和P8为引物,P2～P7为模版通过PCR方法拼接合成巨噬细胞特异性启动子序列,反应条件如下:98℃10s,68℃30s,共30个循环;72℃5min。扩增产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测。　　1.2.2巨噬细胞启动子的克隆及测序鉴定