人端粒酶启动子（htertp）真核表达载体的构建

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1、人端粒酶启动子（hTERTp）真核表达载体的构建【关键词】端粒酶启动子；荧光蛋白；肿瘤Abstract：ObjectiveTocloneDNAsequenceofhumantelomerasereversetranscriptasepromoter(hTERTp),andtoconstructeukaryoticexpressionplasmidofpEGFP-hTERT.Methods1135bphTERTpromoterplifiederasechainreaction(PCR)method

2、,utilizinghumangenomeastemplate.ThehTERTpromoteridnamedpEGFP-hTERTp,andthesequenceesequenceasregisteredinGeneBank.Thesequencecontained1135bp.ConclusionsTheconstructionandtheexpressionofeukaryoticplasmidpEGFP-hTERTphavebeenachievedsuccessfully.Therese

3、archpavedtheorgenetherapyofregulatoryelementsofhTERTp.Keyantelomerasereversetranscriptasepromoter,hTERTp)已经逐渐成为学者们研究的焦点。本实验中，我们采用PCR方法克隆了hTERTp的DNA序列,并将其替换绿色荧光蛋白质粒pEGFP-N1上游的启动子,以便为研究以hTERTp为靶点的肿瘤靶向性基因治疗奠定基础。1材料和方法1.1细菌和质粒大肠杆菌DH5α购买于Takara公司；荧光蛋白质粒pE

4、GFP-N1购买于Promega公司。1.2主要试剂和实验设备DMEM培养基为GIBCO公司产品;质粒小量提取纯化试盒、（1）kbMarker、PCR产物纯化试剂盒为北京威格拉斯技术有限公司产品；PCR引物由大连宝生物有限公司合成；限制性内切酶AseⅠ、BamHⅠ、Taq聚合酶、DNA连接试剂盒DNALigationKitVer.（2）为TaKaRa公司产品；LipofectamineTM2000、Trizol购买于Invitrogen公司；主要实验设备有:Biometrapersonal公司生

5、产的PX2型96孔PCR扩增仪,Bio-RAD公司生产的PCA300型电泳仪。1.3主要试验步骤1.3.1hTERTp的PCR扩增及鉴定　根据GenBank中hTERT序列设计两对引物。DLM1：上游引物5'-GCACCCATAATACTGGGGTGTCTTC-3',下游引物5'-CGCGCTCGCACAGCCTCTG--3'；DLM2：上游引物:5'-TAATTAATCTGTCCTGCGGTTGTGCCGG-3'下游引物:5'-CGGGATCCGAGCGCACGGCTCGGCAG-3'；DLM

6、2引物5'端分别引入限制性内切酶AseⅠ、BamHⅠ的酶切位点(下划线表示)。先以基因组为模板，以DLM1为引物，退火65.5℃进行PCR反应，扩增产物为2068bp；再以第一次PCR产物为模板，以DLM2为引物,退火66℃进行PCR反应，扩增目的片段为1135bp。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶(TAE缓冲液配制)电泳,并用PCR产物回收试剂盒回收纯化［1］。1.3.2pEGFP-hTERTp重组质粒的构建用AseⅠ和BamHⅠ双酶切带酶切位点的PCR产物，用PCR产物纯化试剂盒回收约1135

7、bp的DNA条带；用AseⅠ和BamHⅠ双酶切pEGFP-N1质粒（pEGFP-N1原有的启动子被切掉），酶切产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳回收；上述两种回收产物按质量比为4∶1作连接反应，采用LigationKitVer.2.1DNA连接试剂盒，16℃过夜。将连接反应液转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布于含50mg/L卡那青霉素的LB琼脂板，倒置于37℃恒温箱中过夜培养，次日挑单菌落，接种于10mL含50mg/L卡那青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。取5mL菌液，用质粒纯化试剂盒制备少量质

8、粒，用AseⅠ和BamHⅠ双酶切和PCR两种方法鉴定，并取含pEGFP-hTERTp的菌液1mL送上海生工做DNA序列分析。田力，等：人端粒酶启动子（hTERTp）真核表达载体的构建辽宁医学院学报2008年12月，29(6)2结果2.1PCR产物电泳结果以人类基因组为模板,PCR扩增hTERTp，经1.2%琼脂糖凝胶电泳，得到清晰的1135bp大小的DNA片段(图1)，与预期结果吻合。M：Marker1：PCR产物2.2真核表达载体的鉴定PCR产物或酶切产物分别取5μL与6×LoadingBuf