乳铁蛋白分子组成对成骨细胞增殖活性的影响研究

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1、硕士学位论文乳铁蛋白分子组成对成骨细胞增殖活性的影响研究EFFECTSOFCOMPOSITIONSOFLACTOFERRINONPROLIFERATIONACTIVITYOFOSTEOBLAST王韫哈尔滨工业大学2015年6月国内图书分类号：TS252.1学校代码：10213国际图书分类号：614密级：公开工学硕士学位论文乳铁蛋白分子组成对其促成骨细胞增殖的影响研究硕士研究生：王韫导师：杜明教授申请学位：工学硕士学科：食品科学所在单位：化工学院答辩日期：2015年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学ClassifiedIndex:TS252.1U.D.C:602Dissertationforth

2、eMasterDegreeinEngineeringEFFECTSOFCOMPOSITIONSOFLACTOFERRINONPROLIFERATIONACTIVITYOFOSTEOBLASTCandidate：YunWangSupervisor：Prof.MingDuAcademicDegreeAppliedfor：MasterofEngineeringSpecialty：FoodScienceAffiliation：SchoolofChemicalEngineeringandTechnologyDateofDefence：June,2015Degree-Conferring-Institu

3、tion：HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学工学硕士学位论文摘要乳铁蛋白是一种具有多种生物学活性的蛋白质，多种研究表明其具有抗菌、抗病毒、提高免疫力等功能。近年来的研究发现乳铁蛋白具有促骨生长的作用，是一种预防和治疗骨质疏松的新型骨代谢调节因子。其结构与功能关系引起了广泛关注，因此本研究主要探讨乳铁蛋白分子中结合的铁离子、糖基侧链的存在以及乳铁蛋白的片段，对乳铁蛋白发挥其成骨活性的影响。本研究以天然牛乳铁蛋白为原料，通过透析去除和结合铁离子，肽N-糖苷酶F（PNGase-F）裂解糖链，胃蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶水解作用，分别制备得到了缺铁和铁饱和型乳铁蛋

4、白、去糖基化乳铁蛋白以及不同条件下的乳铁蛋白水解产物。采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）确定了最佳脱铁透析换水次数为7次，间隔时间为8h；最佳结合铁透析换水次数为4次，同样间隔8h。采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确定了PNGase-F作用乳铁蛋白脱除糖链的最佳酶解时间为24h。本研究利用酶原消化新生SD大鼠对成骨细胞进行分离培养、传代，使用不同分子组成的乳铁蛋白及乳铁蛋白肽作用于成骨细胞，MTT法测定细胞的增殖情况。研究结果发现，在促进成骨细胞增殖方面，低浓度剂量组和中剂量组的天然乳铁蛋白（Native-LF）和缺铁型乳铁蛋白（Apo-LF）要比

5、饱和型乳铁蛋白（Holo-LF）效果好，而且随着培养时间的增长，这种优势有扩大的趋势；高浓度剂量组作用后，Apo-LF促进成骨细胞增殖的作用逐渐落后于Native-LF。铁离子有抑制成骨细胞生长的作用。本研究还利用激光共聚焦显微镜研究了不同铁饱和度乳铁蛋白与成骨细胞相互作用的情况，结果表明乳铁蛋白的铁饱和度对于乳铁蛋白是否能够进入成骨细胞内部并无明显的影响。乳铁蛋白去糖链以后促成骨细胞增殖活性明显下降，体现在各个时间点高浓度去糖基乳铁蛋白的促成骨细胞增殖活性显著弱于天然状态的乳铁蛋白，低中浓度去糖基乳铁蛋白在24h、48h没有显著地促成骨细胞增殖活性，中浓度去糖基乳铁蛋白只在72h时能够显著

6、促进成骨细胞增殖，且糖链单独存在时，并没有显著促进成骨细胞增殖的活性。经三种蛋白酶水解1h、2h、4h后的乳铁蛋白肽促成骨细胞增殖的活性要弱于天然状态的乳铁蛋白。本研究阐述了乳铁蛋白不同结构单元对于乳铁蛋白促成骨细胞增殖活性的影响，为进一步深入研究乳铁蛋白的构效关系提供了一定的理论依据。关键词：牛乳铁蛋白；铁饱和度；去糖基化；酶水解；成骨活性I哈尔滨工业大学工学硕士学位论文AbstractLactoferrinisabioactiveproteinwhichhasbeenwidespreadused.Recently,ithasbeendemonstratedtobeananabolicfa

7、ctorforbone.TheeffectofLactoferrinonbonegrowthandmetabolismcanbeappliedtoanti-osteoporosisandtoreducetherelativecomplications.Thebiologicalfunctionsofproteinsdependonitsstructure.Thisstudyfocusesonhowlactof