促成骨细胞增殖的乳铁蛋白肽制备及其生物信息研究

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1、硕士学位论文促成骨细胞增殖的乳铁蛋白肽制备及其生物信息研究STUDIESONTHEPREPARATIONOFLACTOFERRINHYDRIYSATESWITHOSTEOBLASTSPROLIFERATIONACTIVITYANDTHEBIOINFORMATIONCHARACTERISTICS杨戬哈尔滨工业大学2015年6月国内图书分类号：TS252.1学校代码：10213国际图书分类号：614密级：公开工学硕士学位论文促成骨细胞增殖的乳铁蛋白肽制备及其生物信息研究硕士研究生：杨戬导师：杜明教授申请学位：工学硕士学科：食品科学与

2、工程所在单位：化工学院答辩日期：2015年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学ClassifiedIndex:TS252.1U.D.C:614DissertationfortheMasterDegreeinEngineeringSTUDIESONTHEPREPARATIONOFLACTOFERRINHYDRIYSATESWITHOSTEOBLASTSPROLIFERATIONACTIVITYANDTHEBIOINFORMATIONCHARACTERISTICSCandidate：JianYangSupervisor：Prof.Min

3、gDuAcademicDegreeAppliedfor：MasterofEngineeringSpecialty：FoodScienceandEngineeringAffiliation：SchoolofChemicalEngineeringandTechnologyDateofDefence：June,2015Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学工学硕士学位论文摘要乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是一种碱性糖蛋白，主要存在于乳清

4、蛋白中，作为一种新型的骨生长因子，可通过调节骨的生长和代谢过程发挥其功能，促进骨骼生长，相关基础与应用研究已引起广泛关注。乳铁蛋白在被人体摄入后，必须经过胃肠道消化吸收，乳铁蛋白是只能以完整蛋白的形式发挥促成骨作用，还是经过胃液消化之后产生的分子片段也可发挥作用或者两者同时发挥作用未见报道。本研究利用模拟胃液对乳铁蛋白进行不同时间地消化处理，将其分解成不同分子量的多肽片段，经阳离子交换层析和凝胶过滤层析对乳铁蛋白肽进行分离纯化，采用MTT法跟踪监测纯化过程中的样品促成骨增殖活性，筛选出具有较好促成骨细胞增殖活性的多肽。同时，通过

5、生物信息学方法将LF的氨基酸序列与已知具有促成骨细胞增殖活性的蛋白质序列进行比对，进而阐明LF水解片段的结构与其促成骨细胞增殖活性的关系，以此推测LF在经过胃环境消化后的活性机制，主要研究内容及成果如下：本研究首先利用模拟胃液水解LF，水解时间分别为5min、10min、30min、60min、90min、120min、180min和240min。利用SDS-PAGE和TricineSDS-PAGE电泳分析不同水解时间产生的LF水解片段的分子量。实验结果表明：随着水解时间的延长，LF逐渐被水解成小分子量肽段，小分子量肽段浓度逐渐

6、增加。在水解90min之后水解产物趋于不变，分子量约为5kDa。然后利用MTT法进行细胞增殖实验，比较不同时间点LF水解产物对成骨细胞增殖活性的影响。促细胞增殖实验结果表明，H5与其他时间点相比能显著促进成骨细胞增殖。利用阳离子交换层析柱SPSepharoseFastFlow（1.6×10cm）对H5进行分离纯化，在pH7.40.05MPBS缓冲液（盐浓度）为洗脱液，洗脱流速为3mL/min的洗脱条件下，分离得到5个峰，通过MTT法确定峰5具有较好促成骨细胞增殖活性。将峰5进行凝胶层析SuperdexPeptide10/300G

7、L（1.0cm×300mm），在洗脱液为pH7.60.02MPBS缓冲液，洗脱流速为0.5mL/min的洗脱条件下，分离得到2个峰，通过MTT法确定峰5-1具有较好促成骨细胞增殖活性，利用TricineSDS-PAGE电泳确定峰5-1中含有两种组分，分子量分别为9.35kDa和6.95kDa。本研究推测这两种乳铁蛋白肽在乳铁蛋白发挥促成骨细胞增殖活性的过程中发挥了重要作用。将LF与具有成骨细胞增殖活性的骨形态发生蛋白（BoneMorphogeneticProteins，BMP）进行生物信息对比研究表明：LF的氨基酸序列与BMP蛋

8、白具有I哈尔滨工业大学工学硕士学位论文28.56%相似性，相似部分主要集中在LF的第522-597位氨基酸，此段序列的相对分子量大约为9kDa，与我们获得的峰5-1中的一个组分的分子量相近。对此段有较高相似度的保守区域利用生物信息学软件进行理化性质、疏水性、磷酸