仿刺参纵肌带的再生及相关基因表达分析

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1、分类号密级UDC编号硕士学位论文仿刺参纵肌带的再生及相关基因表达分析赵丽娜1014031指导教师姓名李霞（教授）专业名称水产养殖论文答辩日期2013年6月7日学位授予日期2013年6月MASTERALDISSERTATIONLongitudinalMusclebandsRegenerationandRelatedGeneExpressionAnalysisinApostichopusjaponicusSupervisor:ProfessorLiXiaMasterCandidate:ZhaoLinaCollegeofFish

2、eriesandLifeScience,DalianOceanUniversityDalian,P.R.ChinaJune2013摘要摘要仿刺参在不良环境条件下，如海水污染、水温过高、过分密集或某些强烈的刺激时，会引发身体收缩，泄殖腔破裂，把部分或全部内脏排出体外。这是仿刺参抵御敌害和应激环境的一种自保措施，它们有较强的再生能力，去除体内的某些器官之后并不会死亡，而能完整的再生出新的器官。由于仿刺参这种很强的器官再生和修复能力，及其在生物分类上重要的进化地位，研究仿刺参的再生机制具有很高的科研价值，对于高等生物的细胞分化与

3、增殖、组织修复机制有重要意义。(1)以仿刺参为试验材料参考人类外科缝合技术，尝试对仿刺参手术部位进行缝合，建立了一种海参体壁手术缝合的方法。结果取得理想效果，有效解决了海参创伤后伤口难以愈合、化皮死亡的问题。将仿刺参放在盛有0.54mol/L的硫酸镁溶液的解剖盘中麻醉1h，然后用灭菌手术刀沿腹部后1/3处往前纵向切开约2cm切口，深至体腔。采用单纯对合缝合法进行缝合，缝合后放回加有100IU/ml的青霉素和100g/ml的链霉素的抗生素的水槽中培育。结果：试验组仿刺参缝合后，创口在10d时已基本愈合，20d时与正常组织没

4、有区别，且在培育过程中，化皮率10%，死亡率仅5%；对照组未经缝合，其创口愈合时间较试验组平均慢10d，且化皮率高达58.7%，死亡率51.7%。该方法可应用到海参的创伤实验研究以及养殖生产中。(2)采用人工创伤的方法先将仿刺参腹部剖开1cm左右伤口，用剪刀横向剪断体腔背部的纵肌带(longitudinalmusclebands,LMBs)，然后对伤口进行缝合，并将创伤仿刺参在添加抗生素（100IU/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素）的海水中继续饲养。用组织切片的方法观察仿刺参纵肌带再生的形态学和组织学的变化。再生的

5、形态学变化是创伤时，由于纵肌带的收缩，断端出现0.5cm-1cm的间隙；创伤15d，创伤处出现乳白色絮状组织，暂命名为肌前组织；创伤30-45d时，肌前组织逐渐增厚并将断端肌肉组织连接起来；创伤60-90d，肌前组织已转化成纵肌带，并且其厚度增至约正常纵肌带的1/2；创伤后110-130d，新生纵肌带进一步增粗，形态上与未创伤处组织没有区别，只是直径略小一些；创伤150d时，再生的纵肌带增厚至正常状态。其组织学变化过程为创伤后15d，在损伤处出现结缔组织及单个的肌纤维,形成一条不规则的细长的条带，即肌前组织；创伤后30-4

6、5d，肌前组织层增厚，并与体壁间形成一些通道，通道由结缔组织和体腔上皮细胞组成，结缔组织中肌纤维的数量大量增加；创伤后60-90d，肌前组织明显增粗，几乎被肌纤维占据，且通道数量增加，此时肌前组织已转化为肌肉带（纵肌带）；创伤后110-130d，新生肌纤维数量大量增加，和体壁相连的通道数量减少，创伤150d，新生的纵肌带基本达到正常的结构，且通道基本消失。分析认为新生的肌细胞来源于体壁结缔组织细胞和体腔上皮细胞。(3)利用实时荧光定量PCR对仿刺参延伸因子1α（elongationfactors1α,EF1α）基因的表达进

7、行定量分析，发现EF1αmRNA在创伤处理后的纵肌带中各时间点表达明显升高，EF1α在2d表达水平明显增高，表达量是对照组（0d）的30493倍(P<0.01)。其他时间点呈现逐渐上升趋势，30d达到最大表达量，40d后表达量显著高于对照组，且表达水平趋I摘要于稳定。对清道夫受体富半胱氨酸蛋白12基因（scavengerreceptorcysteine-richprotein12，SRCR12）在仿刺参纵肌带创伤后表达变化中，发现SRCR12mRNA在2d、20d、30d以及40d以后的表达量显著高于0d，分别是对照组的4

8、6534、6386、58465倍，而在4d和10d表达差异不显著，且40d以后表达趋势基本稳定。说明SRCR12基因对仿刺参纵肌带的损伤有一定的修复作用。本研究分别从组织水平和分子水平对仿刺参纵肌带的再生过程进行了研究，常规石蜡切片技术保证了组织结构的完整性，能够更直观清晰地观察仿刺参纵肌带再生的全部过