ccctc-结合因子调控细胞抗凋亡蛋白xiap表达的研究

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1、CCCTc_结合因子调控细胞抗凋亡蛋白XlAP表达的研究摘要至今肿瘤已成为人类的第一杀手，它严重威胁人类及动物的健康。免疫监视等遗传因素、病毒等生物因素、紫外射线等物理因素和环境因素等都会导致肿瘤。有关肿瘤的发生与发展机制的研究一直是生命科学研究的重点与热点。对肿瘤形成机制的研究不仅对肿瘤的治疗有指导作用，而且具有重要的学术意义。CCCTC一结合因子(CCCTC-binding矗lCtor，CTCF)是广泛存在于真核生物中的多功能转录因子。CTCF由727个氨基酸残基组成，中段含有l1个连续的锌指结构，锌

2、指结构可以形成不同的组合，识别不同的靶序列表现出不同的功能。目前发现，CTCF通过转录抑制与激活、基因沉默、染色质绝缘等作用调控多种靶基因的表达。在多种肿瘤细胞中均可检测到CTCF的表达，CTCF表达水平与肿瘤的组织学分级显著相关。Docquier等研究表明CTCF表达水平与乳腺癌细胞抗凋亡能力有关，CTCF可能参与抑制细胞凋亡过程。本研究首先在宫颈癌细胞株HeLa中探求CTCF与细胞凋亡之间的关系。在以前的研究中，我们利用RNA干扰的方法，已构建CTCF表达受到显著抑制的HeLa细胞株，命名为HeLa．

3、CTCF细胞，CTCF的表达水平下调约70％。本实验利用紫外照射、化疗药物顺铂和阿糖胞苷三种不同的方法分别诱导HeLa、HeLa．CTCF细胞株凋亡，继续培养24h后，经Hoechst33342／PI双染后，荧光显微镜下观察细胞凋亡，用h11age．Pro⑩P1lls软件对细胞计数，计算细胞凋亡率，用SAS软件进行统计学分析。在0．02J紫外照射下，HeLa-CTCF细胞凋亡率为(29．59±3．50)％，高于HeLa细胞凋亡率(11．00±3．06)％。细胞经5“∥Inl阿糖胞苷处理后，HeLa．CTC

4、F细胞凋亡率为(4．98±0．25)％，高于HeLa细胞凋亡率(2．01±O．24)％。30p∥武顺铂作用于细胞24h，HeLa．CTCF细胞凋亡率为(18．02±3．96)％，高于HeLa细胞凋亡率(10．01±1．55)％。使用三种不同的方法处理细胞，HekCTCF细胞的凋亡率均高于HeLa细胞，结果有统计学意义(p

5、具有抗凋亡作用。为了进一步研究CTCF抗凋亡作用的具体机制，应用基因表达芯片在HeLa细胞中筛选受CTCF调控的靶基因，筛选结果表明CTCF与X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(Xchromosomelinkedin址bitorof印optosisprotein，XL心)的表达水平相关。XL"属于凋亡抑制蛋白(iI蚵bitorsofapoptosis，IAPs)家族的一员。队Ps是一类在结构上具有同源性的细胞凋亡抑制蛋白家族。研究发现MPs与肿瘤、神经细胞凋亡等疾病有关。XL哲在L廿s抑制正常细胞凋亡的过程中起到

6、统领作用。X脚既可以通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(CaSpaSe)激活级联反应抑制凋亡，也可通过参与信号传导途径等起到抑制凋亡作用。在HeLa、HekCTCF细胞中利用半定量PCR、Westem-blot检测Xm的表达水平，结2果表明：HeLa-CTCF细胞株中Xm的mRNA和蛋白表达水平比较正常HeLa细胞均显著下降。CTCF表达受到抑制时，XIAP表达量相应降低。这说明CTCF对XL廿的表达起正向调控作用。利用不同转染试剂不同转染条件将表达绿色荧光蛋白的质粒pEGFP．C1转染HeLa细胞，应用转染试剂

7、EI衄aIlste卜D转染时，质粒量与转染试剂的比例为1．却酢．4pl时，转染效率为同组中最高，约为70％。转染条件的确立为CTCF在HeLa细胞中瞬时表达奠定基础。利用表达CTCF的pCMV6．XL5．CTCF质粒，转染HeLa细胞，并构建pCMV6一XL5空载体质粒作为阴性对照。将表达CTCF的质粒pCMV6一XL5．CTCF和对照质粒pCMV6．XL5分别瞬时转染HeLa细胞。利用半定量PCR、Westem-blot检测CTCF、XIAP的表达情况，West锄-b10t结果表明转染pCMV6-XL5

8、．CTCF的HeLa细胞是转染pCMV6．XL5的对照组细胞CTCF表达量的2．14倍。CTCF表达水平增高的HeLa细胞中，X脚表达水平是对照组的1．90倍。实验结果表明CTCF与Xm的表达水平相关，在HeLa细胞中过表达CTCF时，XI时的表达水平相应增高，CTCF正向调控X脚的表达。本课题采用宫颈癌细胞HeLa为肿瘤细胞模型，探求转录因子CTCF与细胞凋亡的关系。研究发现CTCF抑制了HeLa细胞凋亡过程。首次发现CTC