鲢鱼恒定链cdna的克隆及其分子结构与功能的分析

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1、安徽农业大学硕士学位论文鲢鱼恒定链cDNA的克隆及其分子结构与功能的分析姓名：叶显峰申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：祖国掌；余为一201205摘要恒定链(Invariantchain，Ii)是一种非多态性II型跨膜糖蛋白，存在于多种细胞表面，尤其是与免疫相关的细胞表面。Ii链作为MHCII类分子的伴侣蛋白，它主要有以下功能：一、辅助MHCII类分子在内质网中进行正确折叠并迁移出内质网。Ii可以协助MHCll分子的组装和正确运输到内质网中。缺失Ii的小鼠会发生MHCll分子的滞留和不能正确组装。BremesB等发现，Ii链的LI和ML氨基酸

2、对与MHCII—Ii进入内质网途径中起到了引导作用；二、提供MHCII类分子进入内体／溶酶体的靶信号；三、阻止MHCII类分子与内质网的内源性抗原结合。因此，Ii链在MHCII类分子呈递外源性抗原给CD4+T淋巴细胞的过程中起着关键性作用，对于机体的免疫应答具有重要调节意义。研究表明有Ii基因参与的DNA疫苗可增强机体的免疫反应。另外，Ii链也是一些重要细胞因子的受体(如MIF)。哺乳动物和禽类的Ii研究相对较多，而对鱼类Ii研究相对较为滞后。鱼类是比较原始的动物，为研究鱼类矗链的结构与功能，本研究首次克隆了鲢鱼Ii的核苷酸序列，并进行了其分子片段的

3、功能和结构的分析。首先，本实验应用ImPCR和RACE(rapidamplificationofcDNAends)法，从鲢鱼的脾脏细胞中首次克隆了鲢鱼^基因，并进行测序鉴定。分析和比对测序结果，表明该基因cDNA全长为1136bp，其中丌放阅读框为699bp，编码232个氨基酸。其次，进一步将鲢鱼Ii与其他物种(小鼠、人、鸭和鲑鱼等)的Ii氨基酸序列进行比对，发现鲢鱼与其他物种的Ii链有相同的结构域，它们分别是跨膜区、胞浆区、内质网区(包括CLIP区和三聚体区)和甲状腺蛋白(thyroglobulin，№)4个结构域。这与已经发现的哺乳动物和禽类的异

4、构体是相似的。第三，为了进一步分析鲢鱼Ii的基因不同功能区域的关系，在试验中将鲢鱼完整Ii基因序列、剔除跨膜区和剔除跨膜区和胞浆区的Ii序列分别插入真核表达质粒pEGFP．C1，进而转染真核细胞系COS7，发现鲢鱼Ii跨膜区和胞浆区在细胞内具有定位作用。最后，根据推测的氨基酸序列，建立发育进化树，分析不同物种(人、猩猩、人猿、小鼠、野猪、牛、兔子、鸡、鹅、鸽子、鹌鹑、虹鳟鱼、斑马鱼、鲤鱼、鲑鱼)间Ii的同源性。发现鱼类间的Ii链虽然差异比较大，但是比其他物种亲缘性还较高。比对发现鲢鱼与斑马鱼之问的Ii同源性最高(78％)，而与人等哺乳动物Ii的同源性

5、较低(30％～40％)。应用生物信息网站进一步模拟构建和比较不同物种Ii链的3D结构，发现链鱼和小鼠、人和鸡的Ii链在结构域和功能非常相似，甚至在一些具有重要作用的氨基酸是相同的。㈣4㈣㈣㈥帅Y2149963上述结果表明，作为重要的免疫分子，不同脊椎动物动的Ii链，不仅在遗传上具有高度同源性，而且在结构与功能方面仍保持着高度的相似性。研究鱼类Ii链对于对于研究与MHC关系奠定了基础。关键词：恒定链，鲢鱼，RACE，克隆，定位分析AbstractInVariantchain(Ii)isanonpolymo叩hictypeIItransmembraneg

6、lycoprotein，whichmainlyexpressesonthesurfIaceofBcells，macrophagecells，dendriticcellsandthymicepithelialcellsetc．AsachaperoneofMHCIIm01ecule，IimainlyhaSthefollowingmnctions：(1)ItcanfacilitatetheproperfoldoftheMHCⅡheterodimericandegressf．romtheendoplasmicreticulum(ER)；(2)Itcanpro

7、Videatargetingsignalforendosomal／Iysosomalcompartments；(3)ItpreVentspeptidef．romassociatingprematurelywithMHCIImoIecule．SoIiplaysakeyroleinMHCIImolecularpresentingexogenousantigentoCD4+Tlymphocytesa11dhasanimponantregulatedsignificance()nimmunereaction．ItwaSreportedtheDNAVaccin

8、econtainingIigenecouldenhancetheimmuneresponse．InVaria