hIGFⅡcDNA的克隆、表达、及其与骨髓基质细胞增殖的相关研究

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1、华中科技大学博士学位论文hIGF-ⅡcDNA的克隆、表达、及其与骨髓基质细胞增殖的相关研究姓名：肖骏申请学位级别：博士专业：外科学（骨科）指导教师：陈安民2003.5.1竺±茎苎查兰璺塑垦兰堕堡主兰竺丝兰hIGF．IIcDNA的克隆、表达、及其与骨髓基质细胞增殖的相关研究华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科博士研究生肖骏导师陈安民教授中文摘要第一部分IGF．II在骨缺损区不同时间的表达与凋亡的相关性目的。探讨骨缺损区在修复过程中胰岛素样生长因子II(IGF．II)mRNA不同时间／中的表达与凋亡的相关性

2、。／方法建立兔桡骨缺损模型，利用免疫组织化学方法观察、骨缺损区不同时间IGF-II的表达，同时利用末端脱氧核苷酸酶TdT介导的dUTP—X切口末端标记(TdT—mediateddUTP—xnickendlabeling，TUNEL)法，检测细胞凋亡，显微镜下观察并作细胞计数。并进行相关性分析。结果骨折后5—7d间充质细胞、成骨细胞和软骨细胞内均有IGF．IImRNA表达，为高峰期。到14d时表达的细胞数目明显减少。细胞凋亡在骨折后7d数目最多，以软骨细胞和间充质细胞为主。统计学检验证＼少／、一一明IGF-

3、IImRNA的表达与细胞凋亡具有正相关。／厂结论。骨折愈合过程中骨缺损区细胞／‘=!!=：凋亡的发生，可以清除无用的细胞，IGF—II可能直接参加了凋亡的发生。／／【关键词】骨折愈合凋亡胰岛素样生长因子II(IGF一＼免疫组织化学基因表达第二部分中国汉族人IGF．ⅡcDNA的克隆和序列分析～L璺!翌垫查兰塑塑垦兰堕嫂主兰竺!!查基的j突隆中国汉族人tGF一1IeDNA，了籁蕤旁囊与歉美入嚣有竞麓器，著今矮的研究奠定基础。(方法从成人骨骼肌中提取细胞总RNA后，威用RT—PCR方法扩增IGF—lleDNA，

4、分别瘸限铡性波切酶双酶切PCR产物秘DcDNA3真核表达载访，凉￡蓑糖凝胶魄泳霸回收，T。DNA连接酶连接IGF—II基因和pcDNA3载体，将爨组体转化大肠秆菌DH5d，挑选在含氨苄青霉素的LB培养基中生长的菌落提取质粒，酶切鉴定聪测序。结果中溺久IG卜IIcDNA与genebank中发布静久IGF-IIcDNA躐基露突交。DNA序蠢分拆袭t⋯#一t一’明所构建的pcDNA3一IGF—II真核表达裁体设计的究全一致≯褂论>成功地克隆了中图／入IG卜llcDNA，萁窍列与强夕}摄遵夔鏊本一致；褥建了pcD

5、NA3-lG卜l

6、爽孩表达载体。，＼／【关键词】IGF．II基因克陛序列分析真核表达)p／＼～，}8‘2一／。笫三部分IGF-II基因促进兔骨髓基质细胞增殖和成瞥活性的帆镥《研究目的·将入IGF-II基因的真核表达载体pcDNA3一IGF．II，转染原代培养的兔骨●髓撩质细胞(MSCs)，使其谯该细胞中瞬时表达，并研究该表达载体促进MSC增殖的生，翰学活性。f方法将重组溪粒pcDNA3-IGF-II转化大肠秆菌D1J58，挑选在含氨苄青、霉繁的LB培养綦中生长的黼落提取质粒，质粒大量提取后，利用脂质体转染

7、至骨髓基霞缨庭(MSCs)，转染磊36／l、瓣牧获缨麓，蕉RT-PCR裣灞其斌激懿表达窳平，逶过流式细胞仪检测细胞周期状况，测定碱性磷酸酶了解其成骨活性。结果DcDNA3一IGF。lI舆核表达质糖在骨髓基威绸腿(MSC)申进行了辨时表达，与寒转染缨憨翊毙，转染；强稳mRNA水平静明显增高，转染细胞浆中检测到较强的荧光信号，流式细胞仪显示j蕤后MSCslGF．II细胞在S期明显增多，而GoG。期细胞明显减少。ALP活性明最增强结圣{≥+残功逮在爱麓蓦矮缨魏(MSCs)中q45IGF．{l逡行了表达，IGF-

8、{j可以促遂掰scs响增辅和成骨活性。l关键词】錾因；'OF-H；囊菝表达岁转染}蘩霾疗法岁2^蜓心竺±翌苎查兰璺查垦兰些j兰兰兰燮CloningandexpressionofhIGF—IIgeneandstudingtherelationshipofmarrowstromacellproliferationDepartmentofOrthopaedics，TongjiHospitalTongjimedicalCollege，HUSTDoctoralCandidateXiaoJunDoctoralTuto

9、rProf．ChenAuminAbstractPart1：CorrelationbetweenIGF-UmRNAexpressionAndApoptosisduringhealingoftheradiusOBJECTIVEToelucidatethecorrelationofinsulin—likegrowthfactorII(IGF—II)mRNAexpressionandapoptosisduringfracturehea