骨髓基质干细胞的单克隆化培养和多向分化的实验研究

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1、骨髓基质干细胞的单克隆化培养和多向分化的实验研究作者：郑东，杨述华，冯勇，杨操，李进，梅荣成，唐欣，徐亮【摘要】目的通过对骨髓基质干细胞(marroalcells，MSCs)的单克隆化培养、鉴定和扩增，获得从一个单细胞扩增出的大量均质MSCs，并研究其多向分化能力。方法无菌条件下获取大鼠骨髓细胞，在培养的过程中挑出相应的单细胞克隆。将挑出的单细胞克隆与饲养细胞混合培养，快速进行扩增和细胞表面标志的鉴定，并进一步行增殖和细胞分化实验。结果在含有特定饲养层细胞的培养条件下，单克隆来源的MSCs能在抑制分化的状态下大量扩增，并保持细胞的均质性；而且在这种培养条件下，MSCs的增殖能

2、力明显增强，并能成功被诱导向软骨、神经样细胞分化。结论通过骨髓细胞的单克隆培养，获得了均质和多向分化潜能的MSCs，为进一步更精确的研究MSCs的生物学特性提供了基础。【关键词】骨髓基质干细胞　　骨髓基质干细胞(marroalcells，MSCs)被认为是生物工程领域中最具潜力的一种种子细胞，在骨软骨组织工程和神经细胞等的修复中都具有广泛的应用，甚至还有研究表明MSCs还可以分化成肝细胞和胰岛样细胞［1，2］。但是我们对这种细胞本身的研究却不是很完善，本实验就是希望通过对单克隆来源的MSCs进行扩增和鉴定，获得大量均质单一细胞来源的MSCs，并在此基础上进行单克隆来源的MSC

3、s分化的初步实验研究，证明这种成体干细胞的分化和横向分化能力。　　1材料和方法：　　1.1试剂胎牛血清FBS，胶原酶，透明质酸酶，DMEM，胰酶，Trizolreagent试剂盒购自Gibco公司；RT试剂盒，TaqDNA聚合酶为MBI公司的产品；TGFβ3购自RD公司；STRO1、CD34、CD45、OCT4、CD105、Nestin分别购自BioLegend和Serotec公司；丁羟基茴香醚，丝裂霉素分别购自武汉凌飞公司；其他生化试剂分别是国产和进口分析纯。　　1.2方法　　1.2.1大鼠骨髓细胞的原代培养取一月龄SD大鼠(同济医学院动物实验中心提供)，在无菌条件下

4、取出大鼠的股骨，用完全培养基(20％FBS，DMEM低糖，VitC50μg/mL，青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL，两性霉素R0.25μg/mL)分别冲洗骨髓腔，获得的细胞悬液充分打匀，然后用细胞筛网过滤，配成单细胞悬液，将该细胞悬液调整细胞浓度为1×103/mL后接种到培养板中。相差显微镜下观察细胞生长情况，并挑选单个细胞贴壁生长的区域，用笔做好标记。　　1.2.2小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblast，MEF)的获取和培养在无菌条件下获取和分离胚龄为1周的小鼠胚胎，减去头、四肢和内脏，超净台中将胚胎组织剪成肉泥状，碎块大约为1cm

5、3。转移到离心管中，加入0.25％的胰酶5mL，37℃细胞培养箱消化10min。取消化后的上清液，转入10mL的离心管中，加入3mL的完全培养基(FBS10％，DMEM低糖，VitC50μg/mL，青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL，两性霉素R0.25μg/mL)。余下的组织继续按照上述方法同样处理，消化过程进行4～5次。所获得的上清液一起转到一个50mL的离心管中，1000r/min，离心8min，弃上清，将细胞重新悬浮于30mL的完全培养基中，细胞筛网过滤，制成单细胞悬液，调整细胞浓度到2×104/mL，接种于培养瓶中。通过不断的培养传代获得足够的MEF后，再用

6、10mg/L的丝裂霉素进行处理获得mtMEFs(mitomycintreatedmouseembryonicfibroblasts，mtMEFs)备用。　　1.2.3原代骨髓细胞培养过程中，单克隆细胞的挑出、扩增和鉴定将mtMEFs以1×103/mL接种到六孔板中。24h后换液，除去未贴壁的细胞，备用。原代培养骨髓细胞生长到8d时，出现单克隆样生长，在显微镜下通过无菌的方式将克隆样生长的细胞挑出，具体方法如下：首先在单个细胞贴壁生长的区域确定较为独立的具有MSCs生长形态的单细胞克隆，在相差显微镜下用笔在瓶壁上做好标记，然后在显微镜下用消毒后蘸有0.25％胰酶的小片滤纸将单克

7、隆生长的细胞从局部消化，分别接种到载有饲养层细胞mtMEFs的六孔板中，继续培养。当细胞达到80％融合后消化传代，转入培养瓶中进行培养，传到第4代后，将MSCs和新加入的mtMEFs按1∶1混合后再继续培养(因为mtMEF没有增殖能力，mtMEFs传到第4代时细胞会损失殆尽，所以需要补充新的细胞)。如此循环，在培养的过程中不断的补充mtMEFs，直到单克隆培养的MSCs总共传代数为20代(20passageP20)，取P20MSCs进行细胞表面标志(STRO1、CD34、CD45、OCT-4、CD10