华南湍蛙皮肤新型多功能抗菌肽的纯化、鉴定、cdna克隆与功能分析

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1、摘要湍蛙属隶属于两栖纲无尾目蛙科，作为蛙科各属中较为庞大的一个类群，全世界分布有45个种。目前关于湍蛙属两栖类皮肤分泌物中抗菌肽的报道较少，对于湍蛙属两栖类抗菌肽结构和功能方面的研究仍很匮乏。本研究利用蛋白质纯化技术结合蛋白质组学技术，首次成功从分布于中国西南部山区的华南湍蛙皮肤提取物中纯化并鉴定出3种新型抗菌肽，确定了他们的分子结构和功能活性。同时成功从华南湍蛙cDNA文库中克隆到5条抗菌肽cDNA序列，能够推导出5条不同的抗菌肽前体，并能够释放5种不同的成熟抗菌肽。这些成熟肽中的其中3条与纯化出抗菌肽结构相同。经分析这5条抗菌肽隶属于2个多肽

2、家族，它们分别是brevinin．1和brevinin．2。因此，它们被命名为brevinin．1RTa(FLPLLAGVVANFLPQIICKIARKC)、brevinin．1RTb(FLGSLLGLVGKVVPTLFCKISKKC)、brevinin-1RTc(FLGSLLGIj、厂Gl

3、revinin—lRTb和brevinin．2RTb经RP．HPLC从华南湍蛙皮肤提取物中纯化得到，并且利用LC．MS／MS蛋白质组学方法从华南湍蛙皮肤分泌物中除鉴定到了纯化出的这3条多肽外，同时也鉴定出brevinin．2RTa的存在。同时我们通过人工化学合成法合成了这5种多肽来进一步研究其功能活性，经过抗菌活力测试发现本研究中鉴定出的所有多肽对所试的多种微生物显示不同的抗菌活力。此外，brevinin．2RTa和brevinin．2RTb对家兔红血球细胞的溶血活性相对较低，这一发现可能被用于开发新型抗菌药剂。关键词：两栖类；华南湍蛙；蛙皮；抗

4、菌肽IIIAbstractAsoneofthelargeamphibiangroups，thereareatotalof45speciesofAmolopsintheworld．However,theantimicrobialpeptidesexistinginthisgenushasnotbeenextensivelystudied．Asoneofthelargeamphibiangroups，thereareatotalof45speciesofAmolopsthatareknowntodistributemainlyfromwesterna

5、ndsouthernAsia．However,onlyafewofAMPshavebeencharacterizedpreviously．Inthisstudy,cDNAsencodingfivenovelantimicrobialpeptide(AMP)precursorswereclonedbyscreeningtheskin—derivedcDNAlibraryofAmolopsricketti,afrogspeciesthatexistsinsouthernandwesternpartsofChina．Proteinsequenceana

6、lysisledtotheidentificationoffivededucedpeptides，threebelongingtothebrevinin-1familyandtwobelongingtothebrevinin-2familyofamphibianAMPs．Thus，meywerenamedasbrevinin-1RTa(FLPLLAGVVANFLPQIICKIARKC)，brevinin一1RTb(FLGSLLGLVGKVVPTLFCKISKKC)，brevinin-1RTc(FLGSLLGLVGKIVPTLICKISKKC)，b

7、revinin一2RTa(GLMSTLKDFGKTAAKEIAQSLLSTASCKLAKTC)andbrevinin-2RTb(GILDTLKEFGKTAAKGIAQSLLSTASCKLAKTC)，respectively．Theactualpresenceandcharacterizationofbrevinin·1RTa，brevinin-1RTb，brevinin-2RTaandbrevinin-2RTbwasconfirmedbyRP—HPLCandLC-MS／MS-basedproteomicsapproach．Allofthepept

8、idesdisplayeddifferentantimicrobialpotencyagainstavarietyofmicroorga