棕点湍蛙皮肤分泌液中活性肽分离纯化、分子克隆以及结构和功能的研究

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1、中文摘要棕点湍蛙皮肤分泌液中活性肽分离纯化、分子克隆以及结构与功能的研究摘要两栖类是一类具有生态、科研、经济、以及文化价值的自然资源。同时，两栖类皮肤也是具有很大开发潜力的生物资源宝库。两栖类的皮肤中含有种类繁多、功能复杂的生物活性物质，这些活性物质可用来抵御有害环境因子的侵袭。存在于两栖类皮肤分泌液中的生物洚】生成分引起了世界上研究人员极大的关注。迄今为止，已分离鉴定出许多具有各种生物活性的蛋白以及多肽。中国拥有丰富的两栖类资源，在284个种(亚种)中2／3是特有种，在生物活性物质开发方面具有

2、极大的潜力。我们收集了三种两栖类动物：棕点湍蛙(Amolopsloloensis)、无指盘臭蛙(Ranagrahami)以及中国林蛙(Ranachensinensis)，并对这三种两栖类的皮肤分泌液进行了一系列的生物活性筛选：1．胰蛋白酶水解活性检测；2．胰蛋白酶抑制剂活性检测；3．抗茵活性检测；4．溶血、出血及血浆凝固活性检测；5．血小板聚集活性检测；6．血小板聚集抑制活性检测。结果发现，1．三种两栖类的皮肤分泌液都不具有胰蛋白酶水解活性；2．棕点湍蛙以及无指盘臭蛙皮肤分泌液具有较强的胰蛋白酶

3、抑制剂活·『生；3．棕点湍蛙以及无指盘臭蛙皮肤分泌液具有较强的抗茵活性；4．三种两栖类的皮肤分泌液不具备出血活性，但是显示较弱的溶血活·瞄以及抗血浆凝固活性。5．三种两栖类的皮肤分泌液都不具有促进血小板聚集活性；6．棕点湍蛙皮肤分泌液具有抑制血小板聚集活性。以来源于单个棕点湍蛙(Amolopsloloensis)个体皮肤中提取的mRNA为材料，我们建立了棕点湍蛙皮肤cDNA文库，得到大约为lxl06个独立的克隆。通过生物化学，分子生物学手段和研究方法，在棕点湍蛙皮肤分泌液中得到一系列的皮肤活性多

4、肽以及cDNA序列，其中包括抗茵肽，缓激肽，胸腺肽等，并对其结构，功能进行了相应的研究。通过两步分离纯化过程：SephadexG一50凝胶过滤和反相高压液相层析(RP．HPLC)，我们从棕点湍蛙皮肤分泌物中分离纯化得到3个、2类别的抗茵肽，并命名为amolopin．1a，lb和1c。借助于质谱，我们得到这三个抗茵肽的分子量分别为2665．3、2663．7乖1626．0道尔顿。这两类抗菌肽都含有多个碱性氨基酸而带有正电荷，这是首次从湍蛙属中分离纯化得到的抗菌肽，进一步丰富了两栖类抗茵肽类群。我们所

5、得到的3个抗茵肽，其中2个由24个氨基酸残基组成，具有半胱氨酸组成的二硫键，形成Ranabox。通过Genbank进行blast，发现该类抗菌肽与来源于Ranaesculenta的brevinin一1E具有87％和79％的同源性。另外一个抗茵肽由16个氨基酸残基组成，不合棕点湍蛙皮肤分泌液中活性肽分离纯化、分子克隆以及结构与功能的研究有半胱氨酸组成的二硫键，可以形成a．螺旋。这类抗菌肽和来源于Ranatemporaria的Temporin．F具有50％的同源性。根据一系列的活性检测，我们发现两类

6、amolopinj％茵肽在一些活性上具有很大的差异。amolopin．1b具有很强的溶血活性和较弱的肥大细胞脱粒肽活性，而amolopin一2a则相反，但是两者都有较强的促进肥大细胞中组胺释放的活性。amolopin．1b和2a都具有一定的抗肿瘤活性。根据编码盈z／'taesculenta中brevinin．1E前体保守的5’端核苷酸区域设计引物，在棕点湍蛙皮肤cDNA文库中筛选编码amolo口in抗茵肽的cDNA序列的单克隆。对所得到的阳性克隆进行测序，我们筛选到编码不同amolopin抗菌肽

7、前体的不同的cDNA序列14条，这14条cDNA序列最终编码3类、8条不同的am010pin抗菌肽。我们将这三类抗茵肽命名为amolopin．1，2，3系列。通过两步分离纯化过程：sephadexG．50凝胶过滤和反相高压液相层析(RP．HPLC)，从棕点湍蛙皮肤分泌物中分离纯化得到一种具有12个氨基酸的缓激肤，我们将该缓激肽命名为amolopkinin。该缓激肽和来源于Ranarugosa的ranakininR具有76％的同源性，具有增强小鼠回肠肌收缩的作用。amolopkinin在N端部分具

8、有插入片段APv，这是首次从湍蛙属得到的缓激肽以及cDNA序列。通过随机筛选棕点湍蛙cDNA文库，我们得到了棕点湍蛙胸腺肽一D4的cDNA全序列，并命名为aT-D4。该cDNA序列由698个核苷酸组成，由其开放阅读框推导出来的胸腺肽组成为44个氨基酸，通过Genbank进行blast发现该胸腺肽和来源于娩nopuslaev／s的thymosinbeta4有90％的同源性。这是首次从两栖类得到来源于皮肤的胸腺肽．p4cDNA全序列。关键词：棕点湍蛙；抗菌肽；缓激肽；胸腺肽一D4Ⅱ英文摘要PURIF