新基因HA117全长cDNA克隆及其耐药功能的实验研究

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1、重庆医科大学博士学位论文新基因HA117全长cDNA克隆及其耐药功能的实验研究姓名：郭玉霞申请学位级别：博士专业：儿科学（血液内科）指导教师：徐酉华20080501重庆医科大学博士研究生学位论文新基因HAl17全长eDNA克隆及其耐药功能的实验研究摘要目的应用组织芯片结合原位杂交的方法筛选出HAl17基因组织表达谱。然后以组织表达谱筛选出的高表达HAl17基因的肾脏组织为模板，通过RACE的方法克隆基因全长cDNA，进一步应用重组腺病毒介导的方法获得高表达HAl17基因的K562、Jurkat细胞，初步研究HAl17基因对K562、Jurkat细胞的多药耐药(MDR)功能。方法1组织表达

2、谱筛选，选取石蜡包埋的31例常见肿瘤组织标本制和17例癌旁正常组织制作组织芯片，应用mRNA原位杂交技术检测HAll7mRNA在组织芯片各种组织中的表达情况；2组织表达谱结果提示肾脏组织高表达HA117基因，收集并提取肾脏组织总mRNA，首先应用RT-PCR方法验证HAl17基因在肾脏组织表达情况；然后在高表达HAll7基因肾脏组织中，根据已获得的已知HAl17基因序列为模板设计特异引物，通过RACE技术克隆HAl17基因全长cDNA序列；3构建携带新基因HAl17全长cDNA序列的重组腺病毒，酶切质粒载体pAdTrack—CMV和目的基因HAl17后，用T4DNA连接酶将载体和目的基因

3、定向克隆连接，然后筛选和鉴定含目的基因HAl17的重组质粒pAdTrack—HAl17。将筛选正确的质粒pAdTrack—HAl17导入已制备的腺病毒同源骨架质粒BJ．Adeasy中，产生腺病毒质粒Adeasy．HAl17，进一步酶切鉴定得到的重组腺病毒质粒Adeasy—HAl17。脂质重庆医科大学博士研究生学位论文体介导的方法将Adeasy．HAll7转染入产病毒包装细胞HEK293，通过乒乓感染，收获高滴度Ad5一HAl17重组腺病毒；并用RT-PCR方法验证，HAll7基因在重组腺并毒Ad5一HAl17感染的HEK293细胞的表达情况；4重组腺病毒Ad5．HAl17体外感染K562

4、、Jurkat细胞，将重组腺病毒Ad5一HAl17体外感染K562、Jurkat细胞，应用流式细胞术及RT-PCR方法检测感染后的K562细胞HAl17表达情况；5检测感染重组腺病毒Ad5一HAl17使HAl17基因高表达后白血病细胞耐药性改变：实验分四组：K562细胞组，K562／Ad5一HAl17细胞组，K562／Ad5．GFP细胞组，K562／Ad5．mdrl细胞组，Jurkat细胞分组同K562。通过对细胞活性、细胞形态学及MTT法抗癌药物敏感实验，柔红霉素排泄实验等检测HAl17基因高表达前后细胞形态及耐药性的变化，初步研究HAl17基因的耐药功能及耐药机制。结果1新基因HAl

5、17mRNA在人体癌旁正常组织和良性肿瘤、恶性肿瘤组织中均有表达，恶性肿瘤组织中表达阳性率高于良性肿瘤及癌旁正常组织中表达阳性率(P>0．5)。在鳞癌和腺癌中的阳性表达率分别是16．67％和61．54％，腺癌中的表达高于鳞癌(P<0．05)。有转移的癌组织中HAll7mRNA的表达率高达70％，明显高于非转移型肿瘤组织的20％(P

6、序列拼接后，得到110bp的全长cDNA序4重庆医科大学博士研究生学位论文歹lj；3经酶切鉴定成功构建腺病毒重组质粒Ad5．HA1l7，重组腺病毒Ad5一HAl17／it戋功转染包装细胞，在细胞内得到良好的表达，并在包装细胞中迅速扩增，获得高滴度的重组腺病毒。收获的病毒感染液滴度达1．5×1011pfu／ml；RT-PCR方法证实外源。

7、生iqal17基因在感染HEK293细胞基因组中功能性表达；4重组腺病毒Ad5一HAl17成功将外源性HAl17基因导入K562、Jurkat细胞，转染48小时后发现随着感染复数的增加，病毒对K562、Jurkat细胞的感染率也增加，MOI值为1OO时细

8、胞的存活率和感染率均较好，转染率分别可以达到39．72％、l7．1O％；RT-PCR方法证实外源性HAll7基因在转染K562、Jurkat细胞基因组中功能性表达；5转染HAll7基因的K562、Jurkat细胞对VCR、AD5M、Vp一16、DNR；MMC、CTX药物的耐药性均比低表达HAl17基因未转染的k562、Jurkat细胞增高，分别增高2～7倍(P