刺参不同组织基因组dna甲基化状态msap分析及hplc方法的建立

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1、学校代码：10264研究生学号：M100107293上海海洋大学硕士学位论文刺参不同组织基因组DNA甲基化状题目：态MSAP分析及HPLC方法的建立TheMethodtoAssessGenomeDNAMethylationofApostichopusJaponicusby英文题目：HPLCandMSAPAnalysisinDifferentTissues专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：水产动物遗传育种姓名：郭婷婷杨建敏研究员指导教师：孙国华副研究员二O一三年五月上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严

2、谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，

3、可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学郭婷婷硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注孙卫明烟台大学教授主席赵建民中科院海岸带研究所研究员委员刘相全山东省海洋水产研究所副研究员委员答辩地点山东省海洋水产研究所答辩日期20130530刺参不同组织基因组DNA甲基化状态MSAP分析及HPLC方法的建立摘要DNA甲基化是一种重要的DNA修饰，它能在不改变DNA一级结构的情况下调控基因的表达

4、，与胚胎发育、组织的分化与衰老密切相关。DNA甲基化是目前新的研究热点之一，是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，能够维持正常的细胞功能，在胚胎发育、肿瘤等疾病的发生、遗传印记中起着重要作用。甲基化在动植物遗传育种中的相关研究主要集中在动植物基因组的甲基化状态、DNA甲基化与基因表达调控、DNA甲基化与分子标记等。一、MSAP技术分析刺参不同组织基因组DNA甲基化状态利用甲基化敏感扩增片段多态性(Methylation-sensitiveAmplifiedPolymorphism,MSAP)技术对五头刺参成体的呼

5、吸树、肠、肌肉和体壁四个组织的基因组DNA甲基化水平进行分析得出了各个组织的甲基化状态。利用MspI/HapII，分别和EcoRI组成两组内切酶酶切基因组，经过预扩增和选择性扩增两步将PCR产物经过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳获得MSAP图谱，条带片段大小多集中在100bp-750bp之间。出现在MspI和EcoRI酶切泳道的为全甲基化位点、出现在HapII和EcoRI酶切泳道的为半甲基化位点、同时出现在两条泳道的为非甲基化位点。通过SpssStatistics17.0统计分析各个组织间的有效数据得知，肠的总甲基上海海洋大学硕士学位

6、论文化水平为28.0%是四个组织中最低的，其中全甲基化位点占15.97%；呼吸树的全甲基化水为35.77%，其中全甲基化位点占19.46%；体壁和肌肉的概率分别为33.51%和32.72%，全甲基化位点各占18.39%和19.18%。甲基化水平由高到低排列依次是呼吸树>体壁>肌肉>肠，不同组织间存在甲基化差异，而且肠与其他组织差异显著(P<0.05)，其余三个组织间差异不显著(P>0.05)，但是呼吸树与肌肉的半甲基化水平差异显著(P<0.05)。体壁与肌肉的差异不显著可能是由于肌肉依附在体壁上取样时分离不显著造成的，而肠和呼吸

7、树是相互分离存在的组织，取样是彼此完全分离，相互间的干扰不强烈所以与其他组织有显著的差异，组织间的甲基化差异跟它们的功能分化相关。DNA甲基化在不同时期，不同组织的差异表达是动植物生长发育所必须的，实验发现刺参的基因组存在甲基化现象而且不同组织间甲基化程度不同，基因组中未发生甲基化的概率大于甲基化的概率，而发生甲基化的位点中全甲基化的概率又大于半甲基化，这可能与甲基化在功能基因调控中起着一定的作用相关。跟其他水产动物相比，刺参的甲基化水平属于中等程度。实验由MSAP分析差异位点通过切胶回收，克隆得到四个甲基化特异性片段，经测序分

8、析功能未知，推测为刺参新功能基因或调控序列区。二、HPLC检测刺参基因组DNA甲基化方法的建立将DNA水解成单核苷酸，采用高相液相色谱技术(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)检测刺参基因组DNA甲基化状态，检测I上