两个携带线粒体nd1 t3394c突变的leber遗传性视神经病变家系的相关研究

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1、温州医学院研究生硕士学位论文论文题目：区仝选堂线趋地=!!箜窆垒￡塞变鲍坠地竺进佳丝塑益经痘童塞丕笪担差婴窒答辩委员会主席：答辩委员会成员：王沥教授(杭州师范大学)白益东教授(温州医学院)金龙金教授(温州医学院)吕斌教授(温州医学院)李红智教授(温州医学院)论文答辩日期：2013年05月17日温州医学院研究生硕士学位论文目录]ll[1llllllllllllllllY239㈣73㈧69中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一4英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一7前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．17结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．25分析和讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．32，J、结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．35参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．36申英文缩略词对照表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．40附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4

3、3综述及参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．44独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．60温州医学院研究生硕士学位论文两个携带线粒体NDIT3394C突变的Leber遗传性视神经病变家系的相关研究中文摘要目的1．在全国各地收集视神经萎缩家系，然后建立临床、家系资料以及分子遗传学资料数据库。2．在收集的视神经萎缩家系及正常对照中筛查与Leber遗传性视神经病变(Leber’Shereditaryopticneuropathy，LHON)相关的线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)三个原发

4、突变位点(NDl／G3460A、ND4／G11778A、ND6／T14484C)，绘制中国LHON人群的突变频谱。3．对其中两个具有典型临床表现和家族史并同时携带有原发突变位点及T3394C突变的LHON家系先证者进行线粒体DNA(mitochondriaDNA，mtDNA)全基因组进行研究分析。4．迸一步分析NDl基因T3394C突变对LHON发病的分子机制，为LHON的诊疗提供新的依据。材料与方法1．通过与北京中医药大学东方眼科医院、中国中医科学院眼科医院、河北省邢台市眼科医院和温州医学院附属眼视光医院合作，以及全国其它医院送来

5、的家系，构建视神经萎缩家系的各地收集网络。经所有受试者同意和温州医学院伦理道德委员会的许可，签署知情同意书后，最后采集外周静脉(肘静脉)血样3-5mL，并收集详细的临床和家系资料(其中包括用Cyrillic软件绘家系图)。2．对受试对象(包括患者和正常对照)进行详细具体的眼科临床检查，包括检测视力(应用标准国际对数视力表)，色觉检查(应用俞自萍色觉图)，视野检查(应用Humphrey视野计)，VEP(应用德国罗兰电生理仪)以及眼底彩照(应用佳能眼底数码彩照)。3．用经典的酚．氯仿抽提法或DNA提取试剂盒法提取全基因组DNA(包含mt

6、DNA)并以其作为PCR扩增模板，对先证者及家系母系成员原发突变G11778A、G3460A和T14484C所在的3个片段进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化后，最后应用自动测序仪进行测序。4．对两个同时携带有T3394C突变和原发突变位点的LHON家系先证者温州医学院研究生硕士学位论文进行进一步的眼科临床检查，详细询问家族史并记录。然后使用设计好的24对引物对其进行线粒体全基因扩增、纯化和测序。5．使用生物软件(包括DNAStar5．0、Chromas2．24、ClustalX1．83等)对测序结果与剑桥序列(NC012920)进

7、行比对分析，确定线粒体基因变异位点及其单体型，分析NDlT3394C对LHON发病的影响。6．根据Genbank选取17种不同进化物种如：人(Homosapiens)、牛(Bostaurus)、鼠(Musmusculus)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)等不同物种对线粒体序列进行种系发生学分析。7．同样，收集116例正常对照(仅限汉族人群)根据上述所述方法抽取3-5mL外周静脉血后进行线粒体基因分析。结果1．自2004年以来，到2012年12月，本课题组己收集了12l8个视神经萎缩家系，其中携带LHON三个原发突变位点的家系

8、504个，包括429个G11778A突变家系、16个G3460A突变家系、59个T14484C突变家系。2．这两个家系表现有典型的LHON临床症状和遗传学特点，家系母系成员分别为17位和13位，外显率分别为24％和46％。3．对家系进