PI3K_AKT_mTOR信号通道调控的子宫内膜癌孕激素耐药细胞自噬机制研究.pdf

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1、分类号：R737密级：公开学校代码：11065学号：Y0114130115专业博士学位论文PI3K/AKT/mTOR信号通道调控的子宫内膜癌孕激素耐药细胞自噬机制研究作者姓名刘华指导教师崔竹梅教授专业领域妇产科学培养单位医学部临床医学院答辩日期2018年5月11日PI3K/AKT/mTOR信号通道调控的子宫内膜癌孕激素耐药细胞自噬机制研究摘要子宫内膜癌(EC,Endometrialcarcinoma)为女性常见的恶性肿瘤之一，占女性生殖系统肿瘤的20-30%。近年来子宫内膜癌发病率有升高趋势，其中年轻患者比例明

2、显增加，随着女性生育年龄的延后，尚未生育或仍要求保留生育功能的年轻子宫内膜癌患者逐渐增多。据统计，90%以上的年轻子宫内膜癌患者病变发现多为早期、局限于子宫内膜、组织学类型多为高分化子宫内膜样腺癌且常常伴有子宫内膜不典型增生，其预后较好，使用高效孕激素治疗可保留患者生育功能，临床已有很多成功的报道。前期研究发现：80%以上的年轻早期子宫内膜癌患者孕激素受体(PR,progesteronereceptor)表达呈阳性，PR阳性患者接受孕激素保守治疗时，其中的86.4%可达到完全病理缓解；研究同时发现部分PR阳性的

3、子宫内膜癌患者对孕激素治疗不产生反应，甚至治疗期间出现肿瘤进展，部分PR阴性的患者反而可对孕激素治疗有反应。目前研究并未完全阐明孕激素治疗子宫内膜癌的机制，对子宫内膜癌孕激素耐药的研究尚少，因而进一步探讨孕激素治疗子宫内膜癌的作用机制，寻找预测孕激素治疗效果的分子标记，深入研究孕激素耐药的分子机制，尝试逆转孕激素耐药并增强孕激素治疗效果是非常有必要的。细胞自噬(autophagy)是细胞在饥饿、能量缺乏等代谢压力下的一种生理过程，自噬与肿瘤发生发展密切相关。自噬一方面可以促进肿瘤细胞生存，但另一方面，细胞自噬也

4、能抑制肿瘤发生。自噬对肿瘤的作用依赖于肿瘤类型和刺激处理的不同，其具体机制尚未完全研究清楚。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)是PI3K/Akt通路的下游分子，临床上以mTOR作为抑制靶点进行用药，可产生抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的效果。目前mTOR与自噬关系的研究已取得较大进展，通过抑制mTOR蛋白的表达，调控自噬活动对临床上肿瘤治疗可能有重要意义。依维莫司（RAD001）是一种口服的mTOR抑制剂，临床前研究表明其可与细胞毒药物或其他靶向药物同时

5、应用于耐药细胞株并产生抑制细胞生长及促进凋亡的作用，RAD001具有广泛的临床应用前景，现已被批准应用于三阴性乳腺癌患者的药物治疗。本研究将细胞自噬与子宫内膜癌孕激素耐药相结合，研究孕激素耐药机制，以期为子宫内膜癌孕激素耐药患者的治疗探寻到新思路。目的:本实验围绕PI3K/AKT/mTOR信号通路调控子宫内膜癌细胞孕激素耐药细胞自噬机制进行研究，主要观察孕激素敏感及耐药的子宫内膜癌细胞中，应用孕激素进行I治疗的过程中相关下游通路及重要靶点蛋白的改变，独立用药与联合用药过程中的自噬变化，并应用RNA干扰、micr

6、oRNA抑制、药物影响、动物荷瘤等多方面实验对子宫内膜癌孕激素耐药细胞的自噬与PI3K/Akt/mTOR通道在其中的作用机制进行探讨，研究药物对于细胞自噬的影响。从抑制mTOR等蛋白的表达，诱发自噬方面入手，探索孕激素治疗以及改善孕激素耐药的可行性。为临床上子宫内膜癌孕激素治疗耐药的解决提供方案。方法：本研究分为两大部分：体外细胞实验及裸鼠荷瘤实验。一：建立细胞模型后进行细胞自噬情况及癌细胞增殖的研究，并应用RNA干扰、microRNA抑制、药物影响等多方面实验对子宫内膜癌孕激素耐药细胞的自噬与PI3K/Akt

7、/mTOR通道在其中的作用机制进行探讨。1、建立细胞模型，利用子宫内膜癌Ishikawa细胞及用醋酸甲羟孕酮（MPA）进行耐药处理后产生的孕激素耐药型Ishikawa细胞，进行细胞自噬情况及癌细胞增殖的研究。①孕激素耐药子宫内膜癌细胞系的诱导：Ishikawa细胞株采用高浓度MPA长期诱导培养；②MTT法检测孕激素敏感Ishikawa细胞及孕激素耐药Ishikawa细胞的在醋酸甲羟孕酮作用下的增殖情况；③Westernblot法检测醋酸甲羟孕酮处理后Ishikawa细胞及孕激素耐药Ishikawa细胞中PR及自

8、噬标志物:LC3B、ATG3、ATG5等的表达。2、对孕激素耐药型的子宫内膜癌细胞中的PI3K/Akt/mTOR通路的激活情况进行研究，并利用此通路中的关键通路分子，对其进行干扰，测定耐药细胞中的蛋白表达情况，推测子宫内膜癌对孕激素产生耐药的分子通路变化及原因。①Westernblot法检测Ishikawa细胞及孕激素耐药Ishikawa细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白