鸡与鹌鹑属间杂交种早期不同性别胚胎小rna文库的构建

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1、分类号：密级：学号：2010108002单位代码：10759石河子大学硕士学位论文鸡与鹌鹑属间杂交种早期不同性别胚胎小RNA文库的构建学位申请人郑炜指导教师赵宗胜教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向动物遗传育种所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年6月ConstructionofSmallRNAlibrariestodifferentgenderembryoofchicken-quailHybridsADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInFulfillmentoftheRequirementsFo

2、rtheDegreeofMasterofAgricultureByZhengWei(AnimalGeneticandBreeding)DissertationSupervisor:Prof.ZhaoZong-shengJune,2013Shihezi,xinjiang,China本课题由国家自然科学基金（项目编号：30660125）——《雌激素受体在鸡与鹌鹑属间杂交胚胎时期死亡中的作用机理研究》资助完成摘要鸡与鹌鹑之间的杂交属于较为典型的远缘杂交，其杂交后代早期胚胎雌性大量死亡，且主要集中在孵化的第3-5天，该时期刚好与其性别分化的时间相吻合，已有研究表明性分化相关基因与其死亡存在一定

3、关联，与性别分化相关的多基因调控机制是比较复杂的，而对小分子非编码RNA（Smallnon-codingRNA）的研究可以从多个途径发现更多的参与调控的基因，为更好的研究鸡与鹌鹑杂交后代在发育早期雌性胚胎死亡和性别分化的机理奠定基础。因此，本研究以鸡、鹌鹑及其杂交后代发育早期的胚胎为试验材料，通过形态学观察和分子生物学方法对其进行准确的性别鉴定后，采用IlluminaSolexa测序技术对孵化第3天的雌性和雄性胚胎发育过程中差异表达的miRNAs进行功能分析，并选择部分差异表达miRNA，分析其在表达趋势与测序结果是否一致；并对可能存在选择性剪接的基因进行分析，旨在对比其同鸡与鹌鹑杂交

4、后代早期胚胎死亡之间存在的关系，具体研究内容及结果如下：（1）采集鸡、鹌鹑及其杂交种孵化第3-5天（每隔12h采样）的胚胎，通过体式显微镜观察发育各时期的形态。结果表明，杂交胚胎发育各时期的形态变化介于其父本鸡与母本鹌鹑的中间，各时期的形态发育与已有研究相一致，且鸡、鹌鹑及其杂交胚胎发育第3天的形态特征基本一致。与此同时，以未知性别鸡与鹌鹑杂交胚胎为研究对象，成年鹌鹑翅静脉采血提取血液DNA为对照，参照用特异性引物2550F/2718R扩增出的鹌鹑W染色体上染色体螺旋蛋白基因（CHD基因）保守区进行性别鉴定，同时从mRNA水平扩增Wpkci基因进一步验证DNA水平性别鉴定的可靠性。结果

5、表明从DNA水平对孵化早期胚胎性别鉴定的准确率为100%，可以应用于家禽早期胚胎的性别鉴定，同时保证了本研究采样的准确性。（2）以形态学和DNA水平扩增CHD基因进行准确性别鉴定为基础，通过Illumina测序平台对杂交雌性和雄性3天龄的胚胎进行SmallRNA深度测序，结合生物信息学的方法对雌、雄胚胎中预测了新的miRNA和对已知miRNAs的类型、长度、丰度以及参与的GO分析和KEGG通路等进行统计。结果显示，鸡与鹌鹑属间杂交早期雌性胚胎组织的比对序列有16058009条，雄性胚胎组织有17943294条，且其长度均以22nt为主；雌性胚胎预测得到132种miRNA，雄性胚胎预测得

6、到460种miRNA；雌性和雄性样本间差异显著的miRNA有117个（P<0.01）；随机选择差异表达的4个已知miRNAs和3个候选的miRNAs进行实时荧光定量PCR（Real-timePCR），其表达趋势与测序结果一致，证明测序结果的真实性。然后对其中部分miRNAs的靶基因预测、GO分析和KEGG通路分析表明，这些差异miRNAs的靶基因主要参与了Apoptosis信号通路、MAPK信号通路、TGF-beta信号通路等与胚胎生长发育、性别分化相关的途径，并发现已有研究报道的与性别分化相关的靶基因：两性和鼠源单克隆抗体-3相关转录因I子1（DMRT1）、雌特异性表达转录因子1（F

7、ET1）和性别决定基因组9（SOX9）等，提示这些差异表达的miRNA及其靶基因可能参与了鸡与鹌鹑杂交早期胚胎性别分化的发生过程。（3）根据已报道的DMRT1b型转录本设计特异性引物，以鸡、鹌鹑及其杂交早期胚胎组织提取的RNA反转录的cDNA为模板，PCR扩增得到两条目的条带，对其回收测序后发现，这两种扩增产物的片段大小分别为547bp和105bp，与原序列的915bp相比，均存在缺失，其在性别分化中所起的作用，有待进一步研究分析。综上所述，利