利用dge技术筛选鸡×鹌鹑杂交种胚胎早期死亡相关基因论文

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1、万方数据UsingtheDGEtechnologyscreeningchicken×quailhybridembryosearlydeathrelatedgenesADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByLiQingfeng(AnimalGeneticandBreeding)DissertationSupervisor:Prof.ZhaoZ

2、ong-shengJune,2014Shihezi,xinjiang,China万方数据万方数据石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指

3、定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日万方数据万方数据本课题由国家自然科学基金（项目编号：30660125）——《雌激素受体在鸡与鹌鹑属间杂交胚胎时期死亡中的作用机理研究》资助完成万方数据万方数据摘要鸡与鹌鹑之间的杂交属于非常典型的属间远缘杂交，其杂交后代早期胚胎出现雌性大量死亡，且主要集中在孵化的第3

4、-5天，该时间段刚好与其性别分化的时间相吻合，已有研究表明性别分化相关基因与其死亡存在一定相关性，与性别分化的调控机制比较复杂，参与的基因也很繁多，通过建立数字表达谱，筛选该时期特异表达的与性别分化相关的基因，为更好的研究鸡与鹌鹑杂交后代在胚胎发育早期雌性胚胎死亡和性别分化的机理奠定基础。因此，本研究以鸡、鹌鹑及其杂交后代发育早期的胚胎为试验材料，通过形态学观察和分子生物学方法对其进行准确的性别鉴定后，采用Illumina测序技术对孵化到第3天的鸡、鹌鹑、杂交胚胎进行高通量测序，分别构建了雌性和雄性个体发育第

5、3天的6个DGE文库，筛选它们之间的差异表达基因，分析其在表达趋势与测序结果是否一致，并对与性别分化相关的基因进行分析，旨在对比其同鸡与鹌鹑杂交后代早期胚胎死亡之间存在的关系，具体研究内容及结果如下：（1）采集鸡、鹌鹑及其杂交种孵化第3-4.5天（每隔12h采样）的胚胎，通过体式显微镜观察发育各时期的形态。结果表明，杂交胚胎发育各时期的形态变化介于其父本鸡与母本鹌鹑的中间，各时期的形态发育与已有研究相一致，且鸡、鹌鹑及其杂交胚胎发育第3天的形态特征基本一致。与此同时，以未知性别鸡与鹌鹑杂交胚胎为研究对象，采取

6、成年鹌鹑血液DNA为对照，用特异性引物2550F/2718R扩增出的鹌鹑W染色体上染色体螺旋蛋白基因（CHD）保守区作为对照进行性别鉴定，结果表明CHD基因法对孵化早期胚胎进行性别鉴定的准确率为100%，可以应用于家禽早期胚胎的性别鉴定，同时保证了本研究采样的准确性。（2）以形态学和DNA水平扩增CHD基因进行准确性别鉴定为基础，通过Illumina测序平台对孵化第3天的鸡、鹌鹑、杂交胚胎进行高通量测序，分别构建了雌性和雄性个体发育第3天的6个DGE文库，筛选它们之间的差异表达基因，并对GO分析和KEGG通路

7、等进行统计。结果显示，雌雄鸡、雌雄鹌鹑、雌雄杂交禽胚胎比对到参考基因组的序列分别有2840108、2817776、1343632、1279590、1844727和1824082条；雌雄鸡、雌雄鹌鹑、雌雄杂交禽、雌鸡与雌杂交禽、雌鹌鹑与雌杂交禽的差异表达基因分别有66、1340、72、130和605个，与性别分化相关的差异表达基因分别有4、2、3、9和8个，以雌雄杂交禽为实验组，其它四组为对照组筛选与雌性杂交禽胚胎早期死亡相关的差异基因，包含有HINTW、HINT1、cFOXL2的等基因。随机选择6个差异表达基

8、因进行实时荧光定量PCR（Real-timePCR），其表达趋势与测序结果一致，证明测序结果的真实性。然后对它们进行GO分析和KEGG通路分析表明，这些差异表达I万方数据基因主要参与了Wnt、p53、Osteoclast、PPAR、TGF-和MAPK等与生长发育、生殖、细胞的增殖分化相关的信号通路。对与性别分化相关差异表达基因分析发现，这些基因不但参与性别分化过程，而且均参与细胞的循环和分化过程，