鞘磷脂合酶ⅰ在氧化应激损伤中的表达及其作用机制研究

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1、中图分类号UDCR7436lO硕士学位论文学校代码密级10533鞘磷脂合酶1在氧化应激损伤中的表达及其作用机制研究Theroleofsphingomyelinsynthase1inoxidativestressinducedN2acellapoptosisandtheunderlyingmechanism作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：论文答辩日期翌!兰：三：壹涂然然临床医学神经病学湘雅二医院胡治平教授答辩委员会主席皇丝三兰兰～中南大学二O一三年五月原创性声明一本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研

2、霄工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特另,J／JD以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明’确的说明。作者签名：王金缱熊日期：上翌生年』月鱼日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论．文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授

3、权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：立垒丝结师签名饵日期：丛年』月生日＼，鞘磷脂合酶1在氧化应激损伤中的表达及其作用机制研究摘要目的：～探讨鞘磷脂合酶1(sphingomyelinsynthase1，SMS1)在氧化应激诱导的Neuro．2a细胞凋亡中的作用，与神经酰胺和ERK通路的关系，探讨SMS1可能的神经保护机制。研究方法：1．体外培养小鼠脑神经瘤细胞(N2a)细胞，用不同浓度梯度的过氧化氢(hydrogenperoxide，H202)建立氧化应激模型，

4、并用MTT法和光镜显微镜评价模型。用Real．timePCR并Elwesternblot检测不同浓度梯度H202处理的细胞中SMSl的基因和蛋白水平变化。2．实验分为对照组、H202组、H202+D609组和D609组。对照组：用含1％小牛血清的高糖DMEM培养液孵育N2a细胞24h；H202组：用含1509MH202的培养液孵育N2a细胞24h；H202+D609组：用SMSl的抑制剂50ktMD609孵育N2a细胞3h后，加入终浓度为150pM的H202培养液孵育N2a细胞24h；D609组：先用抑制剂509MD609孵育N2a细胞

5、3h，然后改用含1％小牛血清的高糖DMEM培养液继续孵育N2a细胞24h。采用Real．TimePCR法从基因水平检测SMSl表达，Western．blot法从蛋白水平检测SMSl及磷酸化细胞外信号调节激酶(phospho-extracellularsignal—regulatedkinase，p-ERK)表达。质谱．液相色谱联用分析法检测神经酰胺水平。Hoechst33342染色法和流式细胞仪测定各组细胞凋亡率。结果：1．H202刺激后细胞的形态发生变化，MTT显示：MTT的吸光度值随着H202浓度的梯度样升高而逐渐降低，表明H202

6、降低了细胞活性。2．H202组(509M，1009M，1509M)呈浓度依赖性地上调SMSl的蛋白和基因水平的表达。3．与正常N2a细胞对照组相比，H202(1509M)处理组显著上调细胞内SMS1的蛋白和基因表达水平(PD．05)。4．与对照组相比，H202(1509M)处理组可升高细胞内神经酰胺水平(P

7、，SMSl抑制剂D609预处理可使H202刺激导致的神经酰胺增多更加显著(P

8、se1inoxidativestressinducedN2acellapoptosisandtheunderlyingmechanismABSTRACTobjective：Toinvestigatewhet