青藤碱对rankl和lps诱导的破骨细胞的影响及作用机制研究

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1、博士学位论文南方医科大学2010级博士学位论文青藤碱对RANKL和LPS诱导的破骨细胞的影响及作用机制研究EffectsofSinomenineonRANKL—inducedandLPS—inducedOSteoclastandtherelativemechanisms课题来源：国家自然科学基金项目(81073119，30801413)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院贺龙刚刘叔文药理学学术型博士研究生药学院2013年5月20日广州博士学位论文青藤碱对RANKL和LPS诱导的破骨细胞的影响及作用机制研究博士研究生：贺龙刚指导教师：刘叔文教授摘要骨代谢的稳定需要破骨细胞(os

2、teoclasts，OCs)介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成作用间的动态平衡和偶联，在健康个体中，二者维持功能平衡，而平衡一旦打破则可能导致骨骼疾病的发生。骨破坏主要是由异常的OCs活化造成的，过度骨破坏可能导致一些常见疾病，如类风湿关节炎、骨关节炎、骨髓炎、牙周炎等。目前对于这些疾病的药物治疗相当有限，主要依赖于糖皮质激素、免疫抑制剂、抗生素或非甾体抗炎药，然而这些药物不能逆转骨质侵蚀，有的甚至有反作用。OCs是体内唯一负责骨吸收的细胞，靶向抑制OCs活化被认为是逆转骨破坏最有效、最直接的治疗策略，目前已经成为该领域的研究热点。OCs起源于骨髓单核．巨噬细胞谱系细胞，在体内必须依赖于一

3、些诱因诱导分化发育为多核的成熟OCs。目前认为最直接活化OCs的内源性分子是激活核因子NF．v．B受体的配体(receptoractivatorofnuclearkappaBligand，RANKL)。RANKL通过和OCs膜上受体RANK结合，募集形成TRAF6和c．Src复合体，激活下游信号通路(NF．rJ3、MAPK和Ca2+通路)通过胞内信号传导途径激活核转录因子NF．r,B、AP．1和NFATcl，激活OCs相关基因表达，例如抗酒石酸碱性磷酸酶(tartrateresistantacidphosphatase，TRACP)，金属基质蛋白酶9(matrixmetalloprotei

4、nase．9，MMP．9)，整合素p3(integrinl33)和组织蛋白酶K(cathepsinK)，促进OCs分化，增强骨吸收活性，抑制其凋亡，最终导致OCs数量增多、功能亢进。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)被认为是导致慢性G一菌感染骨丢失的最中文摘要主要介质，被认为与诱导OCs活化密切相关，其诱导机制目前认为包括：通过诱导成骨细胞中RANKL的表达来控制OCs的分化和激活；通过刺激巨噬细胞产生TNF—a，IL—l和IL一6等炎症因子以及延长OCs的生命周期。青藤碱是传统抗风湿中药青风藤中的主要活性成分。具有明显抗风湿、抗炎、免疫抑制等药理作用。其相关制剂在临床

5、上对各种风湿病具有确切疗效。尽管相关研究发现青藤碱具有降低骨破坏程度的效果，但是否能调控OCs仍未见有报道。本课题以青藤碱为研究对象，利用体外RANKL和LPS诱导OCs体系及体内Mt诱导的佐剂性关节炎骨破坏模型和LPS诱导的急性颅骨骨破坏模型，探讨青藤碱对OCs的调节作用及分子机制。主要内容包括三部分：1．青藤碱对RANKL诱导的OCs的影响；2．青藤碱对RANKL诱导的OCs的作用机制；3．青藤碱对LPS诱导的RAW二OCL的影响及机制。实验方法：1)通过CellTiter．Glo法和CCK．8法考察不同浓度青藤碱(0．125、0．25、0．5、lmM)干预不同时间(6h、24h、48

6、h、5d)对RAW264．7细胞的生存影响，确定合适的体外用药浓度。利用体外RANKL诱导RAW264．7细胞形成OCs体系，通过TRACP染色计数评价青藤碱(O．25、0．5、1mM)对OCs形成和生存的影响；通过骨片吸收实验对骨凹陷和骨吸收面积统计分析评价青藤碱(0．5、lmM)3天内对成熟OCs骨吸收功能的影响；利用标记FITC的鬼笔环肽染色评价青藤碱(1mM)6h内对OCs肌动蛋白环结构的影响；采用Real．TimePCR技术，检测青藤碱(0．25、0．5、1mM)对RANKL诱导的RAW264．7细胞相关基因TRACP，MMP一9，c—Sre，Integrin133和cathep

7、sinK表达水平的影响。建立Mt诱导的佐剂性关节炎sD大鼠骨破坏模型，评价青藤碱(i．p．80mg／kg／day)和阳性药物雷公藤多甙片(i．g．2．5mg／kg／day)对模型动物足踝肿胀、骨破坏病理变化、OCs数量、骨参数(组织矿物质密度、骨矿物质密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量，骨小梁分离度)及血清中相关细胞因子RANKL、骨保护素(osteoprotegerin，OPG)、TRACP5b和碱性磷酸酶(al