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1、RNA干扰技术抑制成骨细胞RANKL基因对结核因子诱导破骨细胞生成的影响张元豫李坤(通讯作者)(新疆自治区人民医院脊柱外科830000)【摘要】A的利用RNA干扰(RNAi)技术抑制小鼠成骨细胞核激活因子受体配体(LigandofreceptoractivatorofNF-JB,RANKL)的表达，观察成骨细胞RANKL/OPG比值的变化，探讨成骨细胞与结核因子诱导的破骨细胞生成的相关性。方法合成4条RANKL序列特异性小干扰RNA(siRNA),用Liopfectamin2000转染成骨细胞，采用荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)检测RANKL的表达，筛选出最有效的干扰序列，并用We
2、sternblot技术检测成骨细胞的RANKL、OPG的表达，观察RANKL/OPG比例的变化，采用成骨细胞破骨细胞共培养技术探讨转染后的成骨细胞对由结核因子诱导的破骨细胞生成的影响。结果合成的4对siRNA屮有一对可使小鼠成骨细胞的RANKLmRNA水平下降80%,蛋白表达下降72%;同时OPG的蛋白表达无明显变化,RANKL/OPG比例明显丁调，破骨细胞的生成明显受到抑制。结论RNAi沉默RANKL基因表达可显著K调成骨细胞RANKL/OPG的比值，抑制由结核因子所诱导的破骨细胞生成。【关键词】核激活因子受体配体RNA干扰小鼠成骨细胞基因沉默【屮图分类号】R39【文献标识码】A【文
3、章编号】2095-1752(2013)23-0092-02RANKL/RANK/OPG系统是破骨细胞分化激活最重要的信号传导系统。成骨/基质细胞膜上表达的RANKL分子与破骨细胞前体细胞膜上RANK结合，刺激破骨细胞前体发育。成骨细胞还可分泌OPG,能竞争性与RANKL结合,因此可以抑制破骨细胞生成[1],是极具发展前途的基因治疗靶位。1998年来逐渐发展成熟的RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术是一种十分有潜力的基因功能研究和基因治疗方法，它是通过小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)触发的序列特异性mRNA降解所致的基因沉默方法[2
4、],较其他基因抑制的方法具奋高效、特异、快速、容易操作等优点。本研究利用RNAi技术降低成骨细胞RANKL的表达，观察其是否可以阻止结核因子所诱导的破骨细胞的形成，探讨骨关节结核的发病机制及相应治疗上的新思路。1材料与方法1.1主要试剂:小牛血清（GiBco公司）,DMEM（DulbeccopsmodifiedEaglepsmedium）培养基（GIBCO公司）,A-MEM培养基（GIBCO公司）,脂质LipofectAMINE2000（美国Invitrogen公司），抗小鼠RANKL抗体（SantaCruz公司）,抗小鼠OPG抗体（武汉博士德公司）。1.2成骨细胞的培养:取新生2d的
5、Balb/c小鼠5只，引颈处死,75%乙醇浸泡消毒5min。无菌条件下取颅骨，仔细剥离骨膜和周围组织。加入0.25%胰蛋白酶5ml室温消化5〜lOmin。用含小牛血清的DMEM培养基洗涤2〜3次。剪碎至lmm3大小,接种于培养瓶。每2〜3d更换培养液,待细胞生长完全覆盖瓶底后开始传代。实验采用3〜5代的成骨细胞。1.3siRNA的合成筛选:GenBank中检索Bab/c小鼠全长的RANKL基因序列，根据http://wwwambioncom/echlib/misc/siRNAfinderhtml设计4对针对RANKL的siRNA如下:siRNAl5—3-GTGTGCACCATCGCTC
6、AGTdTdT,反义链ACAGAGCGAUGCUGCAGACdTdT;siRNA25—3-GACTCGACTCTGGAGAGTGdTdT,反义链CACUCUCCAGAGUCGAGUCdTdT;siRNA35-—3-GCTCCAGCTATGATGGAAGdTdT,反义链CUUCCAUCAUAGCUGGAGCdTdT;siRNA45-—3-ACTCTGTCCTCTTGGTAGCdTdT,反义链GGTACCAAGAGGACAGAGUdTdT;阴十生X寸，照、5cy3cUUCUCCGAACGUGUCACGUTTZ反义链ACGUGACACGUUCGGAGAATT。siRNA的合成委托上海生物工程
7、技术有限公司完成。转染前Id将培养好的Balb/c小鼠成骨细胞按3×105/孔接种在6孔培养板中，细胞密度达70%〜80%吋用Lipofectin2000TM将siRNA转染入细胞。siRNA的转染终浓度为187nmol/L。转染方法按照Lipofectin2000TM说明书操作，空白对照组仅用无血清培养基,每组设3个复孔，实验重复3次。转染后48h提取细胞总RNA,用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）筛选1对最奋效的siRNA,进
