酵母双杂交技术筛选cpn0147和cpn0308配体的研究

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1、分类号：单位代码：10092密级：擘号：20090109酵母双杂交技术筛选CpnO147和Cpn0308配体的研究单位：专业：研究生姓名：河北北方学院医学检验学院痛原生物学田颖新导师姓名及职称：贾天军教授研究起止日期：2011．4．2013．4提交日期：2013．5河北北方学院学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北北方学院所有。河北北方学院有权对本学位论文进行交流、公开和使用。导师签名：研究生繇嗽暂如&年r月》日研究生学位论文

2、独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。导师签名：研究生签名：fll敌暂bB年S月知日目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3英文缩写⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5研究论文酵母双杂交技术筛选Cpn0147和Cpn0308配体的研究前言。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1／刚舌．．；⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．材料与方法⋯．·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．25附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．29附表⋯⋯：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36讨论⋯⋯：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37结论与展望：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．42参考文献⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．43综述衣原体包涵体膜蛋白的研究进展⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯49致谢⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．58个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．59中文摘要酵母双杂交技术筛选Cpn0147和Cpn0308配体的研究摘要肺炎衣原体(Chlamydiapneumon娩Cpn)是一类严格的细胞内生长并具有独特的二相发育周期的病原微生物，主要引起呼吸道和肺部感染，并与心脑血管疾病的发生、发展密切相关。现有研究显示部分衣原体基因编码的分泌性蛋白以及包涵体膜蛋白(inclusionprotein，Inc)在衣原体的一系列生命活动过程中扮演重要

5、角色，其中Cpn0147与Cpn0308为己发现的衣原体包涵体膜蛋白，但其对衣原体生长发育的影响及与宿主细胞的相互作用机制尚不清楚。为此本研究构建了HeLa细胞的酵母GAL4AD融合的cDNA文库，应用酵母双杂交技术寻找Cpn0147，Cpn0308的配体蛋白，为进一步探讨Cpn0147，Cpn0308的特性和可能的生物学作用提供了前瞻性研究。首先，采用Trizol法从HeLa提取总的RNA，应用SMARTTM技术，以CDSIII、SMARTIII为引物，同时加入MMLV反转录酶合成eDNA第一链，在经LD．PCR合成双链

6、eDNA后用CHROMASPIN蹦+TE．400柱纯化双链eDNA，去除200bp以下的片段；将制备好的dscDNA与pGADT7．Rec、HerringTestsCarrierDNA(已变性)转化到酵母Y187感受态细胞中进行同源重组，在SD／-Leu／Amp+平板上培养4d后，用冷冻培养基收集菌体，做菌落PCR检测文库多态性；经琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR产物大小在0．3～3kb之间，显示文库具有良好的多态性。然后从Cpn菌株AR39基因组qbPCR扩增特异性片段Cpn0147，Cpn0308，经限制性内切酶EeoR

7、I和BamHI双酶切后克隆到诱饵载体pGBKT7@；经菌落PCR、EcoRI／BamHI双酶切初步验证后，以pGBKT7载体上的T7引物作为测序引物进行碱基序列测定，测序结果经BLAST分析证实为Cpn0147，Cpn0308，将构建成功的诱饵质粒同时转化酵母菌株AHl09和Y187，经检测无自激活和细胞毒性作用。最后分别将诱饵基因pGBKT7．Cpn0147，pGBKT7．Cpn0308与HeLa细胞酵母GAL4AD融合eDNA文库进行酵母双杂交；用B一半乳糖苷酶印膜法、质粒PCR进行筛选，并通过回交实验进行验证；对阳性

8、质粒进行碱基序列测定，经BLASK比对检测其同源蛋白，确定筛选基因。结果显示，Cpn0147、Cpn0308与HeLa细胞cDNA文库中多个基因的编码产物发生了相互作用，其中Cpn0147杂交结果包括脂肪酰辅酶A结合蛋(了(ACBD3)、环腺苷酸应答原件结合蛋白3(CREB3)、低密度脂受体相关蛋白lI