酵母双杂交系统技术介绍

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2、子生物学工具ClontechMatchmaker™GeneFunctionGeneExpressionGenediscovery背景介绍:MatchmakerGold系统酵母单杂交-蛋白与DNA的相互作用Matchmaker™GoldYeastOne-HybridLibraryScreeningSystem（630491）酵母双杂交-蛋白与蛋白的相互作用Matchmaker™GoldYeastTwo-HybridSystem（630489）Makeyourown“Mate&Plate™”librarySystem(630490)酵母三杂交—三个蛋白

3、之间的相互作用pBridgeThree-HybridVector（630404）背景介绍:MatchmakerGold系统原理ReporterGene酵母单杂交酵母双杂交酵母三杂交ReporterGeneReporterGene主要内容酵母双杂交的背景介绍酵母双杂交的基本原理Clontech酵母双杂交系统常见问题分析基本原理:酵母双杂交参考文献Nature.1989Jul20;340(6230):245-6.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.FieldsS,SongO.De

4、partmentofMicrobiology,StateUniversityofNewYorkatStonyBrook,StonyBrook11794.63000次引用基本原理:GAL4转录因子的结构ADDNA-BDGAL4蛋白具有两个功能结构域BD结合结构域AD激活结构域基本原理:GAL4转录因子的分子机理在GAL4based双杂交系统中:正常情况在酵母细胞内:PromotergalmetabolicgeneGALUASTranscriptionADBDReporterGeneGAL4AD基本原理:三个启动子，四个报告基因获得阳性克隆子报告基因表

5、达AbA抗性筛选Ade营养筛选His营养筛选X-a-gal蓝白筛选M1G1G2降低假阳性！主要内容酵母双杂交的背景介绍酵母双杂交的基本原理Clontech酵母双杂交系统常见问题分析ClontechMM系统的优点SMART方法与同源重组技术结合构建文库，聪明的酵母自己做克隆。AbA抗性筛选的添加，有效抑制背景生长，大大降低假阳性。文库构建于型酵母菌株α型Y187中，方便后续与a型菌株Y2HGold进行mating直接筛选。ClontechMM系统:蛋白互作基本流程验证蛋白互作自己构建文库：630490预制细菌文库：638802（传统型）预制酵母菌文库

6、：630480（均一化，通用型）Clontech蛋白互作相关试剂盒文库筛选文库构建酵母双杂交系统：630489酵母菌转化试剂盒：630439酵母培养基（套装）：630495插入片段检测：630497酵母质粒提取：630467体内验证：630489630305体外Co-IP验证：630458630459631723631604文库构建:ClontechMM文库构建方法SMART合成cDNA共转化，涂板培养，收集菌液文库分装，冻存1mlmatingAAAAAAAAATTTTTTTTCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGCCCAAAAAAAAAT

7、TTTTTTTGGGLD-PCRCCCAAAAAAAATTTTTTTTGGGSMART合成cDNA共转化，涂板培养，收集菌液文库分装，冻存1mlmating聪明的酵母自己做克隆SD/Leu-Y187同源重组SMARTcDNA两小时构建文库文库构建:ClontechMM文库构建方法SMART合成cDNA共转化，涂板培养，收集菌液文库分装，冻存1mlmatingSD/Leu-文库构建:ClontechMM文库构建方法文库构建:ClontechMM自制文库筛选SMART合成cDNA共转化，涂板培养，收集菌液文库分装，冻存1mlmatingY187，AD文

8、库Y2HGold，BD诱饵培养液DDO/X/A混合QDO/X/A文库筛选:ClontechMM文库筛选630489Matc