酵母双杂交系统课件.ppt

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1、酵母双杂交系统（yeasttwo-hybridsystem）定义(Defination)1背景（Background）2原理（Principle）3特征（Character）5过程（Process）4应用（Application）6定义（Defination）将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域基因和激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。BACK背景（Background）真核生物基因转录需要反式转录激活因子（如Gal4等）的参与，真核生物转录因

2、子含有两个不同的结构域：DNA结合结构域（DNA-bindingdomain）及转录激活结构域（activationdomain）。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，后者可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。Fig.Gal4boundtoitssiteonDNABACK原理（Principle）酵母转录因子（1）诱饵蛋白（Bait,与BD融合）（2）靶蛋白（TargetproteinorPrey,与AD融合）报告基因LacZ、HIS、GFP、RFP、GUS、NOS等均可作为报告基因酵母

3、双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。原理（Principle）ADPreyADPreyBaitDNA-BDGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneBaitDNA-BDBACK1、将蛋白X的cDNA序列与BD序列融合，构建成诱饵质粒。2、将蛋白Y的cDNA序列与AD序列融合，构建成文库质粒。过程（Pr

4、ocess）过程（Process）3、将这两种质粒转化入酵母细胞（缺乏报告基因启动子）中。4、利用报告基因的表达筛选相互作用的蛋白（文库筛选）。BACK优点高敏感性真实性简洁性广泛性特征（Character）缺点假阳性较多转化效率低阴性干扰BACK应用（Application）分析已知蛋白之间的相互作用对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功

5、能。绘制蛋白质相互作用系统图谱在药物设计中的应用利用酵母双杂交发现新的蛋白质与蛋白质的新功能将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-文库载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。应用（Application）利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用应用（Application）利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可

6、研究抗原和抗体之间的相互作用，但它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响应用（Application）对于能够引发疾病反应的蛋白相互作用可采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（GenomeProteinLinkageMap）应用（Application）基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多

7、新的基因和EST序列。利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（GenomeProteinLinkageMap）应用（Application）基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列。利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因

8、之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。BACKThankyou