酵母双杂交系统.ppt

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1、用酵母双杂交系统研究蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质之间相互作用研究的重要性蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。研究蛋白质相互作用的常用方法酵母双杂交（yeasttwohybridization）亲和层析免疫共沉淀蛋白质交联基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法噬菌体显示系统筛选酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋

2、白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。第一节酵母双杂交系统简介它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。该技术既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。一、酵母双杂交系统的建立和基本原理经典文献出处FieldsS,SongO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.Nature,1989,340(6230):245-246（一）酵母双杂交系统的建

3、立1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)。该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：转录激活因子DNA结合结构域(BD)(DNAbindingdomain)转录激活结构域(AD)(activationdomain)这两个结构域各具功能，互不影响,单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活

4、特定基因表达的激活因子的功能。Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，天然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多肽链。两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的1～147位多肽构成，能识别位于Gal4基因的上游激活序列(upstreamactivationsequence，UAS)。此外，在其N-端还具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768～881位多肽构成。当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。Fields和Song将两个融

5、合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。其中，SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是已知可以相互作用的。当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近,形成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的DNA-BD可识别位于Gal4效应基因的UAS，并可与之结

6、合；Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合，激活UAS下游报告基因LacZ的转录。酵母转录因子（Gal4）与BD-fusion---诱饵（bait）与AD-fusion---猎物或靶蛋白（preyortargetprotein）报告基因（reportergene）---LacZ（编码β-半乳糖苷酶）（二）酵母双杂交系统的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)repor

7、tergeneGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneXDNA-BD酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:易于转化、便于回收扩增质粒具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相互结合报道株经改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞。基因组中GAL4基因是缺失型的基因组中引入额外的报告基因LEU、TRP、HIS改造后的酵母细胞的特点：通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落表达“诱饵”和“猎物”蛋白；检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的

8、报告基因。做法：首先构建能表达“诱饵”和“猎物”蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。二、酵母双杂交系统的基本策略三、酵母双杂交系统的优点高敏感性。原因：①采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达；②激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；③通过mR