外显子拼接法克隆紫杉烷2_羟基化酶基因与生物信息学分析

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1、生物技术通报·研究报告·BIOTECHNOLOGYBULLETIN2011年第4期外显子拼接法克隆紫杉烷2α-羟基化酶基因与生物信息学分析1，2121，21，21，2黄仕杰陈平陈晓阳辛燕花郭丽琼林俊芳12(华南农业大学食品学院，广州510640;华南农业大学生物质能研究所，广州510640)摘要:紫杉烷2α-羟基化酶是形成紫杉醇核心骨架的羟基化反应关键酶之一，以taxusin作为底物进行氧化生成2α，7β-dihydroxytaxusin。利用蔓地亚红豆杉的总DNA为模板，采用PCR技术克隆出紫杉烷2α-羟基化

2、酶的DNA序列，利用在线比对和生物学软件分析其内含子，采用外显子拼接法克隆出紫杉烷2α-羟基化酶基因的cDNA序列。测序结果表明该基因含有1个1488bp的开放阅读框，编码495个氨基酸的多肽;同源性比较分析结果表明，其碱基序列及氨基酸序列与已经报道的加拿大红豆杉的紫杉烷2α-羟基化酶基因的一致性为分别为98%和89%。利用SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其列进行了序列分析，为利用代谢工程的方法生产紫杉醇或其前体物质提供了分子基础。关键词:蔓地亚红豆杉紫杉醇紫杉烷2α-羟基化酶基因克隆生物信

3、息学MolecularCloningofTaxoid2-alpha-hydroxylaseGenefromTaxusxmediabyExonSpicingandSequenceAnalysis1，21，221，21，21，2HuangShijieChenPingChenXiaoyangXinYanhuaGuoLiqiongLinJunfang1(CollegeofFoodScience，SouthChinaAgricultureUniversity，Guangzhoug510640;2InstituteofBi

4、omassEnergy，SouthChinaAgricultureUniversity，Guangzhou510640)Abstract:Taxoid2-alpha-hydroxylaseisoneofthekeyenzymesthatcatalyzesthehydroxylationreactionofcoreskeletonoftaxol;itcanuse(taxusin)asasubstrateandcatalyzethe7β-hydrotaxusintoform2α，7β-dihydroxytaxusi

5、n．Inthisstudy，thegenomicDNAoftaxoid2-alpha-hydroxylasefromTaxusxmediawasisolatedbyPCR．TheDNAsequencewasanalyzedbysoftwaretofigureoutthein-tronsandexons．Basedonthisanalysisresult，specificprimersweredesignedtoamplifytheexonsequenceswhichwerethensplicedbyPCRrea

6、ction．TheresultofsequencingshowedthatthelengthoftheDNAsequenceandcDNAsequenceis1659bpand1488bp，re-spectively．Thegenecontainedanopeningreadingframeof1488bp，whichcodedfor495aminoacidresidues．TheresultofalignmentshowedthatitscDNAsequencehas97%similaritytothetax

7、oid2-alpha-hydroxylasegeneofTaxuswallichianavar．chinensiswhichhasbeenreportedinNCBI，anditsproteinsequencehas95%similaritytotaxoid2-alpha-hydroxylaseofTaxuswallichianavar．chinensis．Bioinformaticssoftwareswereusedtoanalysistheproteinsequence．Thisresearchcouldp

8、rovidethemolecularbaseforproducingTaxolanditsprematurematerialsbymetabolicengineering．Keywords:TaxusxmediaTaxolTaxoid2-alpha-hydroxylaseGenecloneBioinformatics紫杉醇(Taxol)是20世纪70年代发现的一种紫杉醇(C47H51N