烟草碳酸酐酶基因的克隆及其生物信息学分析

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1、分类号Ｓ３７２学号Ｓ２ＣＩ１２２２０２‘四川农化大擎硕ｄｔ学位论文烟草碳酸酢酶基因的克隆及其生物信息学分析■ｉ／杨蘭■指导教师各黎明副巧巧学科专业种子科学与技术研究方向姻蒂赢质遗传／？？．．，．２０１５年６月ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭａｓｌ：ｅｒＤｉｓｓｅｒｔａ村ｏｎＣｌｏｎｅａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣａｒｂｏｎｉｃａｎｈｙｄｒａｓｅＧｅｎｅｏｆｔｏｂａｃｃｏ

2、ＢｙＹａｎｇＬａｎｇＤｉｒｅｃｔｅｄｂｙＰｒｏｆ．ＬｕＬｉｍｉｎｇＳｅｅｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ？Ｊｕｎｅ２０１５论文独削性亩明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：

3、年＾月日关于论文使用授权的声明目本人完全了解四川农业大学有关保留，：、使用学位论文的规定Ｐ学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借、、阅，可１＾采用影印缩印或扫描等复制手段保存汇编学位论文。同意四川农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。□本论文不保密。□本论文保密，在年解密后适用本授权。‘‘’’（请在Ｗ上□内划ａ／）研究生签名：年／月／＾Ｔｆ＾ｉ＾＞＾摘要绿色植物光合作用是在可见光照射下，叶绿素将Ｃ〇２和Ｈ２０转化为有机物，

4、并释放化的化学过程。光合作用就是积蓄能量和形成有机物的过程。送个过程对于整个生态界的碳循环来说是必不可少的，是作为植物生存的关键存在的。实验前期Ｗ不同主产区的云烟８７烟草叶片作为试验材料，采用比较蛋白质组学方法，对宜宾、广元、西昌和米易四个具有代表性的特色烤烟生态区进行了烟叶蛋白质组学研究，探索了不同生态区烟叶的蛋白质组差异。米易生态区烟叶在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电Ｍａｒｋｅｒ指示的泳时在蛋白质１７ＫＤａ大小左右出现明显差异条带。之后又在双向电泳中鉴定出差异条带中包含五种蛋白，它们分别是稱脂氨谷脫甘肤过氧化物酶、细胞

5、色素、硫氧还蛋白、泛素和碳酸酢酶。比较发现碳酸酢酶（ＣＡ）一是，、种与光合作用相关的酶，针对于碳酸巧酶（ＣＡ）的文献中研究发现大豆玉米和水稻植物的碳酸巧酶活性与其净光合速率之间都呈显著相关，碳酸巧酶活性的高低对净光合速率都有较大影响，然而在烟草中与碳酸巧酶相关的研究报道。较少本研究克隆了前期试验发现的差异条带中的碳酸酌酶基因，并对该基因进行了生物信息学和功能分析：。主要研究如下（１）通过同源克隆法，从烟草同源克隆基因，利用生物ｂ一信息学分析，发现开放阅读框为５２５ｐ，编码１７４个氨基酸，个Ｐ碳酸巧酶结构域，属于

6、Ｐ碳酸巧酶。克隆后测序序列通过在线ＮＣＢＩ数据库中的ＢＬＡＳＴ同源性分析，发现该基因序列与烟草有９７％相似度；马铃著拼以有９０％的相似度；与番茄有８９％的相似度；与芝麻扔Ｃ４有７８％的相似度。克隆序列与其它学者登录的序列基本一致，说明在同种植物中该基因保守程度非常高。（２）对ＣＡ蛋白进行理化性质分析，蛋白理论等电点为５．９２，ＣＡ蛋白分子量为３４．５１ＫＤ，化学式为Ｃ８５出Ｕ３４化。化４ｓＳ９，不稳定指数为５５．１１，半衰期为３０ｈ，脂肪族指数为９５．２５，总平均疏水性（ＧＲＡＶＹ）为０．２６２，由ＧＲＡＶＹ

7、可知－２之间且为正值ＣＡ蛋白，烟草ＣＡ蛋白ＧＲＡＶＹ值在２和，，则此为疏水性蛋白。Ｉ（３）利用旧ＣＰ的在线工具ＳＯＰＭＡ对碳酸巧酶的二级结构进斤预测，得出结－果为；该酶蛋白的二级结构主要由６３个氨基酸残基构成占巧．７２％的ａａｌａｈｅｌｉｘ拍个氨基酸残基形成占２９２５％的无规则卷曲ｒａｎｄｏｍ螺旋ｐｈ，．（）（ｃｏ－ｉｌ）、延伸链占（ｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄ）２７．８３％，由少量的氨基酸残基构成Ｐ转角ｔ．１；维结构ｂｅａｔｕｒｎ占１３２％。利用同源性建模法构建的烟草碳酸巧，（）酶得出烟草碳酸巧酶届于Ｐ

8、型碳酸肝酶。（４）１２－Ｃ入到农杆菌ＬＢＡ４０构建ＰＢＩ１４表达载体，将其转４中，通过菌落ＰＣ民鉴定阳性克隆。采用叶盘转化法进行转基因操作，，经筛选获得