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1、猪TYR基因外显子1的克隆测序及序列分析白小青[基金项目]重庆市中青年科技专家基金项目（合同号：6852）、国家“十五”攻关资助项目（2002BA514A-7-5）[作者简介]白小青（1976—），男，陕西泾阳人，硕士，实习研究员，主要从事生物技术与家畜育种研究。E-mail：jeff499@sohu.com,王金勇（重庆市养猪重点实验室，重庆市养猪科学研究院，重庆荣昌402460）[摘要]本研究对荣昌猪和内江猪的TYR基因外显子1进行了克隆测序及序列分析，结果发现3个新的突变位点：319C→T，537C
2、的插入，551A→G。部分突变序列已被GenBank收录，登录号为:AY236997。将突变序列翻译成氨基酸序列后发现，319C→T和551A→G是同义突变。537C的插入是移码突变，其是否会对猪的毛色造成影响，还有待进一步研究。[关键词]酪氨酸酶基因；序列分析Cloning,SequencingandSequenceAnalysisofexon1ofTyrosinaseGeneinPigBaiXiaoqingWangJinyong(ChongqingSwineScienceAcademy,Rongcha
3、ngChongqing,402460,China)AbstractInthepaper,Thesequencesofexon1oftyrosinasegenewereclonedandanalysedinRongchangpigandNeijiangpig.Asaresult,threenewpointmutations(319C→T，Theinsertionof537C，551A→G)wereobserved.PartmutatedsequencewasreceptedbyGenBankandtheac
4、cessinnumberwasAY236997.TheDNAsequencesweretranslatedintoaminoacidsequencesandtheresultshowedthedisplacemutations(319C→Tand551A→G)belonedsynonymousmutationsandtheinsertionmutationwasframemutation.Wethertheinsertionmutationaffectcoatcolorornot,whichneededt
5、obedeeplystudied.Keywordstyrosinasegene;sequenceanalysis引言猪的各种毛色表型是由黑色素在毛皮质和髓质中沉积的种类和数量的不同造成的。黑色素有2种：真黑色素和褐黑色素[1]。2种黑色素的形成均与酪氨酸的氧化有关，而酪氨酸酶是酪氨酸氧化过程中的关键酶[2]。酪氨酸酶是一种含铜的金属糖蛋白,其主要功能是在黑色素生物合成中催化三步反应：酪氨酸羟化成Ｌ-3,4-二羟苯丙氨酸(多巴),多巴氧化成多巴醌,5，6-二羟基吲哚氧化成吲哚-5,6-醌[3-5]。黑色素实
6、质是多巴醌、吲哚-5,6醌、多巴色素的聚合物[6]。酪氨酸酶由白化位点的酪氨酸酶基因编码,后者发生功能性突变，可导致白化,这已在人[7]、牛[8]、猕猴[9,10]等物种上得到证明。而且，其序列变异与白化病、毛色、肤色的相关性研究已成为一个热点。在猪上，尽管有少量的研究报道[11-13]，但是相对其他物种研究滞后。本研究对荣昌猪和内江猪的TYR基因外显子1进行了克隆测序及序列分析，旨在寻找新的突变，为与该基因相关的研究奠定基础。1材料与方法1.1实验动物纯白荣昌猪2头，大黑头荣昌猪1头，采自重庆市养猪科学
7、研究院猪场。内江猪1头，采自四川省内江市资中县陈家沟乡农户。1.2猪耳组织DNA的提取常规酚仿抽提。1.3引物合成本研究以序列（GenBank:AF181962,AF181963）为参考，采用Giuffra等（2000）设计的引物用于纯白荣昌猪和大黑头荣昌猪TYR基因外显子1的扩增。引物序列为：1F：GCTGGAAAGAGAAGTGTG1R：GCCTTGGACAGAATGATG。引物均由上海国际生物工程公司合成。1.4PCR扩增1.4.1PCR体系DNA模板1µL（100ng），10×PCRBuffer2
8、.5µL，25mMMgcl21.5µL,200µMdNTP2µL,Primer1,Primer2各1µL(25µM),TaqDNA聚合酶0.3µL(5U/µL),加灭菌水至25µL。1.4.2PCR条件95℃预变性5min,然后30个循环：95℃30s，60℃30s,72℃1min.最后72℃保温10min。2结果与分析2.1PCR扩增结果利用材料与方法中所述的引物及条件，扩增基因组DNA，得到目的条带。如图1所示所示。图1猪
