脊髓小脑性共济失调35型致病基因tgm6的细胞功能研究

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1、中图分类号UDCIU44．7610学校代码!Q5三3脊髓小脑性共济失调35型致病基因TGM6的细胞功能研究Thecell-basedfunctionalstudyofTGM6,acausativegeneofspinocerebellarataxiatype35作者姓名i学科专业：研究方向：学院(系、所)指导教师：副指导教师：关文娟临床医学神经病学：湘雅医院唐北沙教授李家大教授答辩委员会主中南大学2013年6月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也

2、不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：燃日期：丛!墨年』月互日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。>日期：互经年』月上日脊髓小脑性共济失调35型致病基因TGM6的细胞功能研究摘要：脊髓小

3、脑性共济失调(Spinocerebellarataxia，SCA)是一大类呈常染色体显性遗传的，具有高度临床和遗传异质性的神经系统退行性疾病。该病多在30岁至40岁左右发病，主要病理改变是小脑和脑干的萎缩，以进行性小脑性共济失调、走路不稳、构音障碍为主要临床表现，有时伴有眼肌麻痹、认知功能障碍、周围神经病、锥体束征和视网膜色素变性等表现。到目前为止，人类已经发现30多种SCA亚型。在前期工作中，我们对中国汉族人群SCA各亚型的分布频率及各亚型CAG重复次数的特点，制定了一套SCA基因诊断流程，建立了SCA致病基因的诊断平台。结果发现，在中国汉族人群中，SCA3最为常见，其次为SCA2、SC

4、Al和SCA7等亚型。近几年，以全基因组外显子测序技术(Wholeexomesequencing，WES)为代表的新一代测序技术具有高通量、高精度、高灵敏度、低运行成本等突出技术优势，为人类遗传疾病的研究开辟了又一个新途径。2010年，我们课题组在国际上率先联合应用连锁分析结果和外显子测序技术克隆了一个新的SCA亚型SCA35的致病基因TGM6，TGM6基因的两种错义突变D327G和L517W都可以致病。2012年，香港学者发现TGM6的另外一种形式的错义突变D150H也可以导致SCA的发生，更进一步证实了我们前期工作的可靠性。TGM6编码的转谷氨酰胺酶6蛋白(Transglutamina

5、se6，TG6)属于转谷氨酰胺酶家族(Transglutaminases；TGs)．TGs是一类钙离子依赖性的转谷氨酰胺酶，在哺乳动物中有活性的TG共8种，主要催化谷氨酰胺上的甲酰胺基团与多种亲核基团反应。TG6在2001年才首次被人类发现，目前尚无关于TG6蛋白的功能研究。为进一步研究TGM6基因突变在SCA35亚型中的发病机制，我们通过过表达野生型及突变型TG6蛋白的细胞模型，进行相关的一系列体外功能实验，包括Westemblot检测蛋白表达及TG6蛋白的降解，TG蛋白酶活性检测，细胞免疫荧光观察其亚细胞定位，GSTpulldown及免疫共沉淀寻找其相互作用的蛋白以及探讨TG6蛋白在细

6、胞凋亡中的作用等研究。结论：(1)成功构建了野生型及两种突变型TGM6重组真核、原核表达载体，为研究野生型TG6蛋白的生理功能及突变型TG6蛋白导致SCA35的发病机制奠定了基础。(2)通过脂质体将野生型及突变型TGM6重组真核细胞表达载体转染至HEK293细胞，Westemblot技术检测TG6蛋白的表达，发现野生型及突变型TG6蛋白的表达量没有明显差异。(3)蛋白稳定性实验证实，突变型TG6蛋白结构稳定性降低，在体内很容易被降解，半衰期明显缩短。(4)细胞免疫荧光结果表明，野生型及突变型TG6蛋白主要位于细胞浆中，与线粒体、内质网、高尔基体没有明显的共定位。(5)TG活性检测发现，突变

7、型TG6蛋白的TG活性较野生型明显下降，尤其以L517W突变体的活性降低最为显著。(6)在HEK293细胞中，野生型及突变型TG6蛋白与polyQ蛋白(ataxin．3．20Q、ataxin一3．70Q、Htt一150Q)存在着部分共定位；GSTpulldown及免疫共沉淀结果表明，野生型及突变型TG6蛋白与polyQ蛋白之间存在着相互作用；且均能通过促进polyQ蛋白由可溶性转变为不可溶进而促使其形成细胞内聚集体。(7