脊髓小脑性共济失调3型可诱导细胞模型的建立

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1、中山大学硕士学位论文脊髓小脑性共济失调3型可诱导细胞模型的建立的技术简单，得到广泛应用。体外模型主要有瞬时转染，稳定转染和可诱导细胞模型，细胞类型主要有PCI2，COS．7，HEK293等。课题组以前曾用PCI2建立过瞬时转染SCA3的细胞模型，经实验者证实这种细胞可以用于SCA3发病机制的研究。但是瞬时转染细胞模型的转染率比较低，难以发现干预后的细微变化；每次转染效率很难完全一致，实验的可重复性也比较差，所以本实验决定建立SCA3的可诱导PCI2Tet．On细胞模型。研究策略：l、载体的构建2、PC12Tet．On细胞的培养及转染3、单克隆的筛选及鉴定4、细胞模型经NGF诱导为神经

2、元后的鉴定方法及结果：一、载体的构建l、目的基因的获取将带有正常CAG重复次数的pEGFPC!Ataxin．3Q28和异常CAG重复次数的pEGFPC1Ataxin-3Q84分别用primer5．0进行酶切位点的分析，选取合适的酶切位点，将带有正常和异常CAG重复次数的Ataxin一3基因从pEGFPCI质粒切下来，琼脂糖电泳将Ataxin．3片段与pEGFPCI片段分离，回收得至S]Ataxin．3片段。2、将目的基因连接至lJpTRE2Hy92-Myc载体中在pTRE2hy92．Myc的多克隆位点上选择合适的限制性内切酶将载体双酶切，将回收的含有正常和异常CAG重复次数的Atax

3、in．3基因分别用T4连接酶连接到pTRE2hy92·Myedfl。3、载体的鉴定将构建好的pTRE2Hy92一Myc—Ataxin-3Q28、pTRE2Hy92-Mye-Ataxin·3Q84与不带有目的基因的pTRE2Hy92·Myc经琼脂糖电泳鉴定，并用作测序鉴定，发现与文献报道序列一致。二、PCI2Tet-On细胞的转染l、筛选单克隆药物浓度的确定中山大学硕士学位论文脊髓小脑性共济失调3型可诱导细胞模型的建立将2×105个细胞接种到的10cm的培养皿中，培养基中分别加入O、50、100、200、400、800ug／ml的潮霉素B，隔天显微镜下观察，每4天换液一次，按PCI2T

4、et．On细胞说明书选取培养5天开始出现大批细胞死亡，第14天细胞基本死亡的潮霉素B的浓度。本实验选取浓度为：200ug／ml。2、PCI2Tet．On细胞的转染将PCI2Tet．On细胞接种于10em的培养皿中，待到细胞长到80％融合的时候，用lipofectamine2000分别将pTRE2Hy92一Myc-Ataxin-3Q28及pTRE2Hy92一Myc-Ataxin-3Q84转染细胞。三、细胞模型单克隆的筛选及鉴定l、单克隆的筛选将转染后的PC12Tet．On细胞用含有200ug／ml潮霉素B的培养基培养，约2周后可以在显微镜下看到转染成功的细胞团，1个月后，肉眼可以看到转

5、染成功的细胞团，每种转染的细胞分别选20个克隆，将细胞重悬种在24孔板。2、细胞模型的Westernblot鉴定将每种细胞的克隆种在25em的培养瓶中，培养到90％融合时，传代后，种到60mm培养皿中培养，加DOX培养4天，收蛋白，做Westernblot，每种细胞选择表达最强的3个克隆：PCI2Tet．OnAtaxin．3Q28选l、9、17：PC12Tet-OnAtaxin．3Q84选3、4、16。再将这3个克隆分别种在60mm的培养皿中，不力nDOX，培养4天收蛋白，做Westernblot，选取基础表达最低的克隆：PCI2Tet．OnAtaxin一3Q28选l；PCI2Tet

6、．OnAtaxin．3Q84背景表达都比较高，在诱导表达次高的4个克隆l、9、12、14中选取背景表达最低的克隆l。3、细胞模型的免疫荧光鉴定将Westemblot选取的细胞模型种皿，分别作加药诱导，诱导培养后免疫荧光鉴定，发现Ataxin．3有表达。四、NGF诱导为神经元后Ataxin-3基因的表达将PC12Tet．OnAtaxin．3Q28和PC12Tet．OnAtaxin．3Q84种在60mm培养皿中，NGF诱导为神经元细胞t故Westemblot发现转染的Ataxin．3仍有表达。结论本实验建立了脊髓小脑性共济失调3型的可诱导细胞模型，可以根据需要调III中山大学硕士学位论文

7、脊髓小脑性共济失调3型可诱导细胞模型的建立控基因表达，便于研究早期发病机制。此外，脊髓小脑性共济失调3型中虽然致病蛋i兰tAtaxin．3可以在各种非神经组织中表达，但主要表现为神经系统的毒性。PCI2可以被NGF诱导为神经元细胞，所以我们的细胞模型更适合于研究讨脊髓小脑性共济失调3型主要表现为神经系统损害的机制。关键词：神经遗传性疾病；遗传性共济失调；脊髓小脑性共济失调；三核苷酸重复扩增IVEstablishmentoftheinduciblecelll