猪reg3和reg4基因克隆和reg4+variant2原核表达

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1、摘要Re够、Re酽是再生基因家族(Reg)的新成员，是近年来新发现的再生基因家族(Reg)的新成员。再生基因家族(regeneratingislet-derivedfamily，REG或Reg)于1988年首次由Terazono等从大鼠再生胰岛的cDNA文库分离得到，属丁钙依赖性凝集素超家族(c-typelectinsuperfamily)，编码的一种分泌蛋白可以刺激胰岛13细胞的生长。目前的研究发现，Reg蛋白可能不仅对B细胞再生非常关键，而且还在哺乳动物其他生理和病理活动中起调节作用，如对肝脏、胃肠道、胰腺细胞起促增殖，抗凋亡作用，此外，与糖尿病、炎症和

2、创伤也有关。根据Reg基冈编码蛋白的一级结构，Reg家族可分为4个型：Regl、Re92、Re93及Re酣，应用生物信息学软件对Reg家族成员进行蛋白序列的比较显示，4个成员在一级结构和三维结构模拟结果均相似，说明它们在进化上的保守性。为了研究Reg在猪体内是否具有同样的功能，我们克隆了猪Re酪、Re酽基冈，并得到了相应的融合蛋白，试验分两个部分。一、猪Re93、Re94基冈的克隆、序列分析与结构预测。利用同源序列克隆原理设计一对克隆引物，对猪十二指肠黏膜组织提取的总RNA进行RT-PCR，将PCR产物与pMDl9．T载体连接后转化E．coliJMl09感受

3、态细胞，筛选阳性克隆、测序，并进行序列分析；结果成功克隆了猪Re93、Re94基冈，并注册到GenBank(Accession．FJ531494，FJ469910，FJ469911)，初步检测了在组织中的分布。二、猪Re94Variant2基冈的原核表达。根据克隆序列设计一对表达引物，用PCR法从重组克隆载体中扩增出EcoRl／HindHI酶切位点的Re94Variant2片段，双酶切后贬克隆至pET21b(+)载体，构建重组原核表达载体pET21b(+)～Re94Variant2，转化宿土菌E．coliBL21，经IPTG诱导进行表达，SDS．PAGE鉴定

4、。结果成功构建了原核表达载体pET21b(+)""Re94Variant2，表达的融合蛋白分子量约为19．23kDa，并以包涵体形式存在。为进一步研究猪Re酣的生物学功能奠定了基础。关键词：猪；Reg；克隆；序列分析；原核表达李义林狮Re93莉1Re94桀I大

5、的克降1jRe94Variant2的原核表达英文摘安CloningofSusscrofaRe93andRe94GeneandProkaryoticExpressionofRe94Variant2inE．coliSupervisor：Prof．YangGuo—yuMasterCandidate：LiWe

6、n．1in·Abstract：Re93andRe94arethenewmembersofregeneratingislet—derivedfamily(REG&Reg)．Regenerationgenefamily(regeneratingislet—derivedfamily，REG，orReg)beisolatedfromratisolatedisletsoftheeDNAlibrarybyTerazonoregenerationin1988．Regfamilyarecalcium-dependentlectinsuperfamily(C—typelec

7、tinsuperfamily)．Theyencodesecretedproteinswhocanstimulatethegrowthofpancreaticpcells．Today，wekownRegproteinmaynotonlycontrolBcellregeneration，butalsoplayimportantrolesinothermammals’physiologicalandpathologicalactivities，suchastheycanbeusedintheproliferation，anti-apoptosisofliver，g

8、astrointestinaltract，pancreascells，Inaddition，theyalsorelatedtodiabetes，inflammationandtrauma．Accordingtotheproteinstructure，Regfamilycanbedividedintofoursubtypes：Regl，Re92，Re93andRe94．TheRegfamilyofastructureandthree-dimensionalstructurearesimilarandthefourmembersareconservedinevo

9、lutionbycomparedproteinseq